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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.31 No.4 pp.378-383
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2019.31.4.378

Metabolic Discrimination of Papaya (Carica papaya L.) Leaves Depending on Growth Temperature Using Multivariate Analysis of FT-IR Spectroscopy Data

Young Bin Jung*, Chun Hwan Kim**, Chan Kyu Lim**, Sung Chel Kim**, Kwan Jeong Song***, Seung Yeob Song****
*Urban Agriculture Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
**Research Institute of Climate Change and Agriculture, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Rural Development Administration, 281 Ayeonno, Jeju 63240, Korea
***Faculty of Bioscience and Industry, CARI, Jeju National University, Jeju 63243, Korea
****Fruit Research Division, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Rural Development Administration, Wanju 55365, Korea
Corresponding author (Phone) +82-63-238-6753 (E-mail) s2y337@korea.kr
October 7, 2019 November 11, 2019 November 18, 2019

Abstract


To determine whether FT-IR spectral analysis based on multivariate analysis for whole cell extracts can be used to discriminate papaya at metabolic level. FT-IR spectral data from leaves were analyzed by principal component analysis (PCA), partial least square discriminant analysis (PLS-DA) and hierarchical clustering analysis (HCA). FT-IR spectra confirmed typical spectral differences between the frequency regions of 1,700–1,500, 1,500–1,300 and 1,100-950 cm-1, respectively. These spectral regions were reflecting the quantitative and qualitative variations of amide I, II from amino acids and proteins (1,700–1,500 cm-1), phosphodiester groups from nucleic acid and phospholipid (1,500–1,300 cm-1) and carbohydrate compounds (1,100-950 cm-1). The result of PCA analysis showed that papaya leaves could be separated into clusters depending on different growth temperature. In this case, showed discrimination confirmed according to metabolite content of growth condition from papaya. And PLS-DA analysis also showed more clear discrimination pattern than PCA result. Furthermore, these metabolic discrimination systems could be applied for rapid selection and classification of useful papaya cultivars.



FT-IR 스펙트럼 다변량통계분석을 이용한 파파야(Carica papaya L.)의 생육온도 변화에 따른 대사체 수준 식별

정 영빈*, 김 천환**, 임 찬규**, 김 성철**, 송 관정***, 송 승엽****
*농촌진흥청 국립원예특작과학원 도시농업과
**농촌진흥청 국립원예특작과학원 온난화대응농업연구소
***제주대학교
****농촌진흥청 국립원예특작과학원 과수과

초록


    서 론

    지구온난화로 인한 평균기온 상승은 1880년부터 2012년 까지 0.85°C가 상승하였고, 현재도 지구온난화가 진행되고 있 는 것으로 보고되어 있다(IPCC, 2013). 우리나라는 기상관측이 시작된 약 100년(1904–2000년)동안 1.5°C 상승하였고(Kwon et al., 2007), 최근에는 연평균 온도가 0.7°C 상승하였다 (KMA, 2011). 기온 상승에 따라 농작물 재배가능지역이 북상 하면서, 제주지역에서 주로 재배되고 있는 한라봉이 전북 김 제로 북상할 것으로 예상된다(Lee and Shim, 2011). 또한, 기 온 상승으로 인하여 제주도에서는 아열대 작물이 재배가 가능 할 것으로 전망되고 있다(Seo, 2003).

    파파야(Carica papaya L.)는 열대 아메리카 멕시코가 원산 지인 다년생 식물로 열대·아열대 지역에서 재배되고 있다. 동 남아 지역에서는 성숙과를 과일로 미성숙과를 채소로 이용하 고 있다. 파파야 미숙과에는 papain 및 항산화 기능을 하는 polyphenol 등이 많이 함유된 것으로 알려져 있다(Krishna et al., 2008). Papain은 단백질 및 펩타이드 안에서 leucine과 glycine 및 염기성 아미노산에 작용하는 단백질 가수 분해 효 소로서 미숙과 파파야 과실에 상처를 내어 유출되는 즙액으로 부터 쉽게 얻을 수 있다(Oh et al., 1997). 이처럼 기능성 성 분이 높아 제주지역 기온변화에 대처할 수 있는 작물이다.

    오믹스 연구기법의 발달은 대사체학 연구를 활발하게 하였 고, 시료간의 대사체 분석을 통해 질적, 양적 패턴 차이를 구명 되고 있다. 또한, 각종 시료의 식별 및 대사체 마커를 개발하기 위해 주로 fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy, proton nuclear magnetic resonance(HNMR) spectroscopy 및 mass spectrometry(MS) 등의 분석 데이터를 이용하여 대사체 연 구를 진행하고 있다(Krishnan et al., 2005). FT-IR spectroscopy 을 이용한 대사체 지문분석기술(metabolite fingerprinting)은 시료의 전세포 추출물을 통하여 전반적인 대사체 정보를 확인 할 수 있는 광학적 분석기술이다. 이를 이용하여 아티초크 품 종 구분이 가능하였고(Kim et al., 2016), 차나무 종간 식별이 가능하였다(Song et al., 2017). 이처럼, FT-IR 분석은 전세포 추출과정이 간편하며 분석 방법이 빠르고 간단하다. 또한, 한 꺼번에 많은 양의 시료를 조사하기 쉽다는 장점을 가지고 있 다. 적외선 스펙트럼 데이터를 기반으로 작물의 품종 또는 재 배 환경에 따른 작물의 품종 식별이나 원산지 식별에 대한 연 구와 기후변화에 따라 변화하는 대사체 정보를 식별하여 우수 한 작물 계통을 선발하는 수단으로 활용이 이루어지고 있다.

    본 연구는 기후 변화에 따른 파파야의 대사체 변화를 관찰 하고 기후 변화에 대응하여 작물의 특성을 식별하여 작물 재 배 환경을 판별하고자 한다.3

    재료 및 방법

    식물재료

    본 연구에 사용된 파파야(Carica papaya L.)는 국립원예특 작과학원 온난화대응농업연구소 도련포장(위도 33.4°, 경도 126.5°)에서 보유하고 있는 온도구배하우스를 이용하여 실험을 진행하였다. 연구에 사용된 파파야의 유전자원 수집종(A: 필 리핀 수집종, B: 태국 수집종)이며 정식시기를 15일 간격으로 다르게 하여 온도구배하우스에서 생육조사와 대사체 분석에 필요한 시료를 준비하였다. 온도구배하우스의 온도처리는 3구 간으로 나누고 구간별로 2°C씩 증가 시켰다(Fig. 1). 각 구간 별로 파파야 잎을 3반복으로 시료를 준비하여 분석에 사용하 였다. 각각의 잎은 동결건조한 후 막자와 막자사발을 이용하 여 분말 형태로 분쇄하여, -70°C 초저온냉동고에 보관하여 분 석에 사용하였다.

    파파야 whole-cell 추출물 제조

    1.5 mL Eppendorf tube에 각 구간별 파파야 잎 분말 시료 20 mg을 넣고 20%(v/v) methanol 200 μL을 첨가하여 시료와 용액이 잘 섞이도록 vortexing하였다. 준비된 파파야 잎 시료 는 50°C water bath에서 30분간 추출하였고, 추출된 시료는 13,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 추출물 찌꺼기가 없도록 새로운 tube에 옮기고, 추출물 찌꺼기 를 완전히 제거하기 위해 다시 한번 13,000rpm에서 5분간 원 심분리하여 상층액을 새로운 tube로 옮겼다. FT-IR 스펙트럼 분석에 사용하기 위해 추출된 추출물은 -20°C에서 냉동 보관 하여 사용하였다(Song et al., 2014).

    FT-IR 스펙트럼 조사와 다변량통계분석

    FT-IR 스펙트럼 조사는 Tensor II (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)를 사용하였고, deuterated triglycine sulfate (DTGS) 검출기로 분석하였다. 추출된 파파야 잎 전세 포추출물 5μL를 384-well ZnSe plate에 3반복으로 분주하여, 37°C hot plate에서 약 25–30분간 완전히 건조하였다. 건조된 ZnSe plate는 Tensor II에 장착된 고효율 자동화 장치(HTS-XT, Bruker Optics GmbH)를 이용하여 스펙트럼을 조사하였 다. 각 시료의 스펙트럼은 4,000–400 cm-1범위에서 4 cm-1간격 으로 총 128회 반복 측정하였고, 측정된 스펙트럼의 평균 스 펙트럼을 분석에 사용하였다. 각 시료의 FT-IR 스펙트럼은 통 계적 분석을 위해 각각 3반복 측정하였다. Bruker에서 제공하 는 OPUS Lab (ver. 7.0, Bruker Optics Inc.) program을 사 용하여 FT-IR 스펙트럼 조사 및 데이터 변환을 하였다. FT-IR 스펙트럼은 control plate 스펙트럼 (background)을 뺀 후 샘 플의 스펙트럼을 나타냈다. 다변량통계 분석을 위해 기본 FTIR 스펙트럼을 OPUS software (ver. 7.0)를 사용하여, baseline correction, normalization 그리고 smoothing 실시하여 전처리 하였다. 전처리된 스펙트럼은 Python (ver. 2.7)을 이용하여 derivative을 실시하였다.

    다변량통계분석은 derivative된 FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 R 통계분석 프로그램 (ver. 3.3.2, Auckland, New Zealand)을 이용하여 분석하였다. 가공된 FT-IR 스펙트럼은 전체 스펙트 럼에서 1,800–800 cm-1영역을 이용하여 Principal Component Analysis (PCA), Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) 그리고 Hierarchical Clustering Analysis (HCA)을 실시하였다. PCA는 Non-linear Iterative Partial Least Squares (NIPALS) 알고리즘에 따라 수행하였다(Wold, 1966). PLS-DA는 PCA 분석 데이터를 이용하여 수행하였다. PCA 분석은 PCA scores를 추출하여 상관 행렬을 계산에 사용하고, PLS-DA는 파파야 온도 처리구간의 대사체 식별하였다. PCA loading value를 실행하여, 파파야 온도 처리구간의 대사체 식 별에 대한 중요 변수를 확인하였고, Hierarchical dendrogram 은 FT-IR 스펙트럼 데이터의 PLS-DA로부터 Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean analysis (UPGMA)를 R program (ver. 3.3.2)으로 분석하여 euclidean distance를 측 정하고 각 시료의 유연관계를 나타냈다.

    결과 및 고찰

    온도구배하우스를 이용한 파파야 시료의 FT-IR 스펙트럼 비교분석

    파파야 시료로부터 전세포 추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터 다변량통계분석을 통해 파파야의 대사체 수준에서 온도처리 간 유연관계 규명하였다. 각 파파야 시료의 FT-IR 스펙트럼을 비교한 결과 파파야 시료들은 FT-IR 스펙트럼상의 1,700– 1,500, 1,500–1,300, 1,100–950 cm-1부위에서 대사체의 양적, 질적 패턴 변화가 크게 이루어짐을 알 수 있었다(Fig. 2). FTIR 스펙트럼의 1,700–1,500, 1,500–1,300 그리고 1,100– 950 cm-1부위는 각각 아미노산 및 단백질의 amide bond I 과 II, 핵산 및 인지질로부터 phosphodiester bond 및 인을 포함 하는 유기산, 그리고 단당류나 복합 다당류를 포함하는 carbohydrates 계열의 화합물들의 질적, 양적 정보를 반영한다 (D’Souza et al., 2008;Dumas and Miller, 2003;Lopez- Sanchez et al., 2010;Parker, 1983;Wolkers et al., 2004;Yee et al., 2004). 즉 FT-IR 스펙트럼 상의 질적, 양적 차이 는 파파야에 함유되어 있는 아미노산, 단백질, 지방산, 그리고 탄수화물계통의 화합물들의 질적, 양적 차이가 현저하게 나타 남을 의미한다. 따라서 FT-IR 스펙트럼 분석은 파파야 시료들 사이에서 주요 대사체의 질적, 양적 변화를 조사하고 온도 증 가에 따른 패턴변화를 분석하여 기후변화에 대응한 품종 선발 이 가능할 것으로 기대된다.

    파파야 시료의 FT-IR 스펙트럼 데이터 다변량통계분석

    FT-IR 스펙트럼 데이터의 PCA 분석 결과 PC 1과 2 score 는 전체 변이량의 각각 16.5%, 15.5%의 설명력을 갖고 있으 며 이는 전체 변이량의 약 32%를 반영하고 있음을 알 수 있 었다(Fig. 3A). PC1과 PC2를 기준으로 파파야 시료들의 PCA score plot을 관찰한 결과, 파파야 시료들은 PC 2를 기 준으로 크게 상하로 구분이 이루어지는 것을 관찰할 수 있었 다. PCA score plot 상측으로부터 +0°C(A)에서 +4°C(C)로 변화하는 것을 볼 수 있다. (A) 그룹은 주로 현재 기온에서 재배되는 파파야가 분포되면서 그룹을 형성하고 있고, (B) 그 룹은 평년 기온에서 +2°C 증가한 것을 가정하여 재배된 파파 야가 그룹을 형성하였다. 또한, (C) 그룹은 (B) 그룹에서 +2°C, 평년 기온에서 +4°C 증가한 것을 가정하여 재배된 파 파야가 그룹을 형성하였다(Fig. 3A). 이는 기온이 증가하면서 파파야의 대사체 변화가 그룹간의 차이를 나타내면서 고온에 대한 변화가 나타난 것으로 판단된다.

    PCA score plot 상에서 기능성 성분들의 함량에 따른 파파 야 시료들의 집단 구분 및 클러스터링에 중요한 역할을 하는 FT-IR 스펙트럼 부위를 조사하기 위하여 PC 1과 2를 결정하 는데 중요한 FT-IR 스펙트럼 부위를 조사하였다(Fig. 3B). Loading value 분석결과 파파야 시료의 상하 구분에 중요한 PC 1을 결정하는 FT-IR 스펙트럼 부위는 주로 1,700–1,500과 1,500–1,300 cm-1region임을 알 수 있었고, 파파야 시료의 상하 구분에 중요한 PC 2의 경우 주로 1,100–950 cm-1region임을 알 수 있었다(Fig. 3B). 이들 FT-IR 스펙트럼 부위는 파파야 시료의 FT-IR 스펙트럼 비교에서 보였던 차이가 큰 부위(Fig. 2)와 일치하는 것으로 amide I, II, 지방산과 carbohydrates 계 열의 화합물들의 질적, 양적 차이가 파파야의 대사체 수준 식 별에 중요한 역할을 하고 있음을 의미하는 결과라 사료된다 (Fig. 3B). 특히 기능성 성분들의 함량 차이에 따른 파파야 시 료의 구분에 있어서 중요한 역할을 하는 PC 2의 경우 amide I, II 계열의 화합물들의 질적, 양적 차이가 크게 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 이 결과로 미루어볼 때 이들 amide I, II 계열의 일차대사산물들의 양적 변화가 이차대사산물의 질적, 양적 변화와 양의 상관관계에 놓여 있음을 의미하는 결과라 사료된다.

    PLS-DA 분석의 경우 PCA 분석 보다 더욱 확실하게 파파 야 시료들의 그룹 식별이 가능하였다(Fig. 4). 처리 온도별 파 파야 시료들의 그룹 경계는 PCA에 비해 더욱 작아졌으며 동 일 온도처리에 속하는 각 시료들의 반복구들도 각 그룹 내에 위치하여 PCA보다 파파야의 식별능력이 향상되었음을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과로 온도구배를 이용한 파파야의 FTIR 스펙트럼 다변량통계분석은 대사체 수준에서 온도 변화에 대한 작물의 변화를 대응할 수 있음을 알 수 있었다.

    HCA dendrogram 분석 결과를 이용하여 온도에 따른 파파 야의 변화를 확인하였다(Fig. 5). PCA dendrogram에서 처리 온도에 따라 그룹을 형성하지만, A-7과 B-7는 온실 입구에 위 치하면서 온실 밖 기온에 영향을 받은 것으로 판단된다(Fig. 5A). 또한, PLS-DA dendrogram에서도 A-7과 B-7은 비슷한 경향을 보였다(Fig. 5B). 아직까지 대사체를 이용한 온도 변화 에 대응한 실험은 없으나, 대사체분석을 이용한 두과작물의 품 종구분(Song et al., 2012), 아티초크의 품종구분(Kim et al., 2016), 대사체 정보를 이용한 아프리칸 얌 기능성 성분 예측 모델링 등 다양하게 이용되고 있다(Song et al., 2014). 이처 럼 대사체 분석을 이용한 품종구분과 온도처리에 의한 대사체 정보 확인을 통하여 기후변화에 대응한 품종 식별이 가능할 것이다.

    따라서 본 연구에서 확립된 생육온도에 따른 파파야의 대사 체 수준 식별 기술은 파파야의 품종, 계통의 신속한 선발 수단 으로 활용이 가능할 것으로 기대되며 더 나아가 육종을 통한 파 파야 신품종개발 가속화에 기여 할 수 있을 것으로 예상된다.

    적 요

    본 연구는 FT-IR 스펙트럼 데이터를 기반으로 다변량통계분 석을 이용하여 생육 온도변화에 따른 파파야(Carica papaya L.)의 대사체 수준 식별을 통해 기후 변화에 대응하여 작물의 육종 연구의 기초자료로 활용하고자 한다.

    1. FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 PCA(principal component analysis), PLS-DA(partial least square discriminant analysis) 그리고 HCA(hierarchical clustering analysis) 분석을 실시하였다.

    2. 파파야 품종은 1700–1500, 1500–1300, 1100–950 cm-1부 위에서 대사체의 양적, 질적 패턴 변화가 FT-IR 스펙트럼상에 서 나타났다. FT-IR 스펙트럼의 1700–1500 cm-1부위는 주로 Amide I 과 II을 포함하는 아미노산 및 단백질계열의 화합물 들의 질적, 양적 정보를 나타내고, 1500–1300 cm-1부위는 phosphodiester group을 포함한 핵산 및 인지질의 정보가 반영 이 되고, 1100–950 cm-1부위는 단당류나 복합 다당류를 포함 하는 carbohydrates 계열의 화합물들이 질적, 양적 정보가 반 영되는 부위이다.

    3. PCA score plot 상측으로부터 +0°C(A)에서 +4°C(C)로 변화하는 것을 볼 수 있다. (A) 그룹은 주로 현재 기온에서 재배되는 파파야가 분포되면서 그룹을 형성하고 있고, (B) 그 룹은 평년 기온에서 +2°C 증가한 것을 가정하여 재배된 파파 야가 그룹을 형성하였다. 또한, (C) 그룹은 (B) 그룹에서 +2°C, 평년 기온에서 +4°C 증가한 것을 가정하여 재배된 파 파야가 그룹을 형성하였다.

    4. PLS-DA 분석의 경우 PCA 분석보다 생육온도에 따른 그룹 간 식별이 뚜렷하게 나타났다.

    5. 본 연구에서 확립된 파파야 생육온도에 따른 대사체 수 준 식별 기술은 파파야의 품종, 계통의 신속한 선발 수단으로 활용이 가능할 것으로 기대되며 육종을 통한 신품종개발 가속 화에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    본 논문은 농촌진흥청 시험연구사업(과제번호: PJ01186201) 의 지원으로 이루어졌습니다.

    Figure

    KSIA-31-4-378_F1.gif

    Change of temperature from temperature growth chamber of year. T1 : Normal temperature, T2 : Normal temperature + 2°C, T3 : Normal temperature + 4°C

    KSIA-31-4-378_F2.gif

    Representative FT-IR spectral from papaya leaves. FT-IR spectral ranges showed quantitative information of protein/ amide I, II (1500-1700 cm-1),phosphodiestergroup(1300- 1500cm-1),andsugarcompound(950-1100cm-1).A1andB1 : Normal temperature + 4°C, A4 and B4 : Normal temperature + 2°C, A6 and B6 : Normal temperature.

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    PCA score plot (A) and loading value plot (B) of PCA analysis from FT-IR data of papaya. Dotted shapes represent significant FTIR spectral region for metabolic discrimination of each papaya plant. A : Normal temperature, B : Normal temperature + 2°C, C : Normal temperature + 4°C.

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    PLS-DA score plot of FT-IR data from papaya. Dotted shapes represent significant FT-IR spectral region for metabolic discrimination of each papaya plant. A : Normal temperature, B : Normal temperature + 2°C, C : Normal temperature + 4°C.

    KSIA-31-4-378_F5.gif

    Hierarchical dendrogram from PCA (A) and PLS-DA (B) of papaya plant.

    Table

    Reference

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