Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.31 No.3 pp.240-248
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2019.31.3.240

Residue Analysis of Phosphamidon, a Highly Toxic Organophosphorus Insecticide Forbidden in Korea

Myoung-Gun Choung
Dept. of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University, Samcheok, 25949, Korea
Corresponding author (Phone) +82-33-540-3321 (E-mail) cmg7004@kangwon.ac.kr
June 28, 2019 July 31, 2019 August 5, 2019

Abstract


Phosphamidon is a typical organophosphorus insecticide which has been used on various crops. The commercial compound of phosphamidon usually contains E- and Z-isomers on vinyl moiety of the molecule. Due to its highly polar nature comparing with most organophosphorus insecticides of mid- to non-polarity, it is desirable to apply separate method for the analysis of phosphamidon residues. This study was therefore conducted to establish an individual method for the phosphamidon residue in crops using GC-NPD/MS. The phosphamidon residue was extracted with acetone from representative samples of five raw products which comprised hulled rice, soybean, Kimchi cabbage, green pepper, and mandarin. The extract was diluted with saline water, and washed by n-hexane partition. Most of nonpolar co-extractives were removed, while phosphamidon still resided in the aqueous phase. Phosphamidon was then recovered from the aqueous phase by dichloromethane partition. Silica gel column chromatography was additionally employed for final clean up of the extract. Phosphamidon isomers were separated and quantitated by GLC with NPD, using DB-17 capillary column. Method validation was performed by recovery experiment on each crop fortified with phosphamidon at 4 levels in triplication. Approximately, the phosphamidon residues existed as a mixture of 90% Z- and 10% E-isomer type. Mean recoveries of total phosphamidon residues, containing approximately 90% Z- and 10% E-isomer, ranged from 84.9% to 100.7% in five agricultural commodities showing that the coefficients of variation were all less than 10%. Limit of quantitation of the method was 0.02 mg/kg, irrespective of crop types. A confirmatory technique using GC/MS with selected-ion monitoring was also provided to clearly identify the suspected residue. Therefore, this analytical method was reproducible and sensitive enough to determine the residue of phosphamidon in import-export agricultural products.



국내 사용금지 고독성 유기인계 살충제 phosphamidon의 잔류 분석

정 명근
강원대학교 생약자원개발학과

초록


    서 언

    농약은 생물의 생리작용을 저해하여 방제효과를 발휘하는 독성 화합물이며, 작물에 살포된 후 농약의 특성이나 환경조건 등에 의해 잔류량이 감소하지만(Kim et al., 1997), 일부 속효 성 약제를 제외하고는 살포 후 작물에 일정기간 이상 잔류되 는 특성이 있어 최종 수확 시 농산물에 살포농약이 잔류할 가 능성이 있으므로, 살포한 농약들로부터의 안전성 확보는 반드 시 이루어져야 할 과제이다(Kwon & Lee, 2003).

    Phosphamidon[(E,Z)-2-chloro-2-diethylcarbamoyl-1-methylvinyl dimethyl phosphate; Fig. 1]은 1956년 Ciba Geigy(Switzerland) 에서 최초 개발되어 “Dimecron”이라는 상품명으로 시판을 시 작한 전형적인 유기인계 살충제로(Hong et al., 2005), 해충의 신경계 중 cholinesterase를 저해함으로써 정상적 자극전달을 차단하여 치사에 이르게 하는 침투성 농약이다(Fritz, 1960).

    상용화된 phosphamidon은 Z-와 E-isomer가 혼합되어 있으 며(Roberts & Hutson, 1999), 다른 유기인계 농약들과 달리 물에 잘 녹는 특성으로 인해 수용액 상태로 완제품이 시판된 바 있어 수질오염의 가능성이 상대적으로 높다(Hong et al., 2005). 우리나라에서도 과거 (주)경농의 다무르, 동부팜한농의 동부포스팜, 한국삼공의 삼공포스팜 및 농협케미칼의 영일포 스팜 등의 상품명으로 시판되었으며(Korea Crop Protection Association, 2015), 국내에서는 고독성으로 인해 환경부 고시 제 2006-34호에 의해 phosphamidon 및 이를 1% 이상 함유 한 혼합물질의 경우 제조, 수입 및 사용이 금지되었으나, 중국 등 전 세계적으로 곡류, 채소 및 과실유 등 다양한 작물 재배 중 해충 방제에 광범위하게 사용되고 있다.

    과거 국내에서는 소나무의 솔잎혹파리 및 솔껍질 깍지벌레 등의 방제, 그 밖에 감자, 고구마, 무, 양배추, 오이, 감귤류, 사과, 수박, 딸기, 배, 레몬, 오렌지, 메밀, 귀리, 밀 및 보리 등 다양한 작물에 진딧물의 방제 용도로 사용되었으며(Korea Crop Protection Association, 2015), 현재 국내 식품의약품안 전처의 농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)은 30종의 식품에 대해 0.05~0.5 mg/kg 범위로 설정되어 있다 (Ministry of Food and Drug Safety, 2017b).

    Phosphamidon의 isomer들은 n-octanol/water 분배계수(Log Pow)가 0.79로 알려져 있는 극성의 비해리성 화합물이며, 녹는 점은 120°C, 끓는점은 162°C이고, 증기압이 2.93 mPa(25°C), 분자량은 299.69(C10H19ClNO5P)인 흰색의 분말로, 다양한 유 기용매와 물 모두에 잘 용해되는 특성을 나타낸다(US EPA, 2009).

    유기인계 살충제인 phosphamidon은 국내 식품공전 7.1.2.2 다종농약다성분 분석법-제2법에 solid phase extraction(SPE) 로 정제 후 gas chromatography-electron capture detector (GC-ECD) 및 nitrogen phosphorous detector(NPD)로 분석 하는 방법이 제시되어 있으나(Ministry of Food and Drug Safety, 2017a), 이 방법은 다성분 분석법을 적용함으로 인 해phosphamidon이 극성화합물 및 이성체의 존재 등 특성에 적합한 최적의 전처리 정제방법과 분석 재현성을 제공하지 못 하는 것으로 판단된다. 또한 다성분 분석법은 monitoring의 목 적으로 분석법이 개발된 것이므로 대상농약을 검출하기 위한 검출기도 최적화 되지 않았다고 판단되며, 실제 농산물을 대 상으로 phosphamidon의 분석조건 확립 및 회수율 등이 검토 된 바 없다.

    따라서 본 연구는 현행 식품공전 다종농약다성분 분석법에 수록된 국내 사용금지 고독성 유기인계 살충제 phosphamidon 의 정확성 및 정밀성이 확보된 단성분 정량분석법을 확립하여 국내·외 수출입 및 유통 농산물 잔류농약 검사에 활용 가능한 공정 분석법을 확립하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 시약 및 기구

    분석 표준품으로 사용된 phosphamidon은 Dr. Ehrenstorfer GmbH(Augsburg, Germany)로부터 순도 96.0%인 제품을 구 입하여 사용하였다. Phosphamidon 표준품의 stock solution은 acetone에 용해하여 1,000 mg/L의 농도로 조제하였고, -20°C 의 냉동고에서 보관하면서 필요 시 마다 acetone으로 재 희석 하여 사용하였다. 흡착크로마토그라피용 silica gel(70~230 mesh)은 Merck Co.(Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 130°C에서 하룻밤 이상 가열하여 활성화 한 후 사용하였다. Acetone, n-hexane 및 dichloromethane은 잔류분석용을, deionized water는 HPLC용을 J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였으며. 기타 유기용매 및 무기시 약은 시약특급 또는 잔류분석용을 사용하였다. 농축기는 Eyela NE-1000SW(Tokyo, Japan)를 사용하였고, 시료의 마쇄 및 균 질화는 고속 호모게나이져(IKA, Ultra-Turrax T-25, Wilmington, NC, USA)를 이용하였다.

    2. 농산물 시료

    식품의 농약 잔류허용기준(Ministry of Food and Drug Safety, 2017b) 중 phosphamidon의 사용이 등록되어 있는 농 산물을 분석대상으로 하였으며, 국내 소비량을 고려하여 곡류 는 현미, 두류는 콩, 채소류는 고추 및 배추, 과일류에서는 감 귤을 대표시료로 선정하였다(Choung, 2019). 대표시료의 무농 약 시료는 지역 대형마트에서 유기농 인증시료를 구입한 후 식품공전에 기재된 검체의 처리방법(Ministry of Food and Drug Safety, 2017a)에 따라 전처리하여 사용하였으며, 대조구 시료는 잔류검사를 실시하여 무농약 시료임을 확인하였다.

    3. GC-NPD/MS 분석 조건 확립

    Phosphamidon은 분자구조 내에 질소, 인 및 염소원자를 각 각 하나씩 함유하고 있어 GC-ECD, NPD 혹은 flame photometric detector(FPD)로 분석이 모두 가능하다. 이들 검 출기 중 FPD는 검출기의 선택성과 안정성은 뛰어나지만 감도 가 NPD에 비하여 낮은 양상을 나타내므로 상대적으로 감도 가 높은 NPD를 phosphamidon 분석을 위한 검출기로 선택하 였다. NPD를 장착한 GC는 Agilent 6890(Wilmington, DE, USA)을 이용하였고, 분리용 칼럼은 내경이 0.53mm인 capillary column을 사용하였고, 분석의 재현성을 증진시키기 위하여 180°C의 등온조건에서 분석하였다. 잔류분의 재확인을 위한 gas chromatography/mass spectrometer(GC/MS) 분석에 는 Agilent 7890/7000 GC/MS(Wilmington, DE, USA)를 사 용하였으며, 각각의 분석조건은 Table 12에 나타내었다.

    4. 표준검량선 및 분석정량한계(Limit of quantitation, LOQ)

    Phosphamidon의 stock solution을 희석하여 0.005~2 mg/L 의 농도가 되도록 농도별 표준용액을 조제하고, 각 1 μL씩 GC-NPD에 주입하여 분석된 peak의 면적을 기준으로 표준검 량선을 작성하였다. 또한, 분석기기의 재현성(reproducibility)을 검증하기 위해 0.5 mg/L의 phosphamidon 표준용액을 GCNPD에 15번 연속 주입하여 크로마토그램 상의 머무름 시간 (retention time, tR) 및 peak 면적(peak area)의 변이를 비교 평가하였다.

    분석법의 정량한계는 무농약 농산물 시료를 분석하였을 때 해당 머무름 시간대에 간섭물질이 존재하지 않음을 확인하고, 분석기기의 정량한계, 시료량 및 분석과정 중의 농축배율을 계 산하여 아래의 계산식에 의해 산출하였으며, phosphamidon을 무농약 시료에 처리한 후 각 처리 농도별 회수율을 검토하였 다(Choung, 2019).

    정량한계(mg/kg) =  [ 기기 정량한계(ng)/시료 주입량(μL) ] × [ 시료용액(mL)/시료량(g) ]

    5. 농산물 시료로 부터 phosphamidon의 추출 및 분배

    대표 농산물 시료 각 25 g에 acetone 100 mL를 가하고(콩 및 현미시료의 경우 추출 전 20 mL의 증류수를 가한 후 30 분간 방치하여 미리 습윤화 함) 호모게나이져를 이용하여 2분 간 고속 마쇄(12,000 rpm) 추출하였다. 추출물은 여과지(Toyo No. 6, Japan)가 장착된 Büchner funnel에서 감압 여과하였고, 시료 및 호모게나이져 컵을 여분의 acetone 40 mL로 세척하 여 여과액과 합하였다. 합쳐친 추출액을 1 L 용량의 분액깔때 기에 옮긴 후 포화식염수 50 mL와 증류수 450 mL를 첨가한 뒤 n-hexane 100 mL로 분배 추출하였다. 추출된 n-hexane 분획을 제거한 수용액은 다시 dichloromethane 50 mL로 2 회 분배 추출 하였다. 2회 연속으로 분배 추출하여 합쳐진 dichloromethane 추출액은 무수 sodium sulfate에 통과시켜 탈 수한 후 40°C 조건에서 감압 농축하였다. 콩 및 현미를 포함 한 모든 시료의 잔류물은 dichloromethane/acetone(90/10, v/v) 10 mL에 재용해하여 silica gel 흡착 크로마토그래피에 직접 공시하였다.

    6. Silica gel 흡착 크로마토그래피

    내경 1.5 cm, 길이 40 cm의 유리 칼럼에 활성화된 silica gel 10 g을 건식 충전한 후, 칼럼 상단에 3 g의 무수 sodium sulfate를 첨가하였다. 충전된 칼럼에 dichloromethane 50 mL 를 가하여 상단에 소량의 dichloromethane만이 남을 정도로 유출시켜고 dichloromethane/acetone 혼합용액(90/10, v/v) 10 mL에 녹인 시료 용액을 가하여 약 3 mL/min의 유속으로 용출시켰다. 충전제 표면이 노출되기 직전 dichloromethane/ acetone 혼합용액(90/10, v/v) 100mL를 첨가하여 용출시킨 후, 계속하여 dichloromethane/acetone 혼합용액(80/20, v/v) 150 mL를 용출시켜 phosphamidon성분을 회수하였다. Phosphamidon 이 회수된 용출용액은 40°C의 수욕상에서 감압 농축하였고, 농축 잔류물에 acetone 10 mL를 첨가하여 용해한 후 GCNPD로 분석하였다.

    7. 농산물 대표시료에 대한 phosphamidon의 회수율 검정

    확립된 phosphamidon 잔류분석법의 분석 효율 및 신뢰성을 확인하기 위하여 대표 농산물 무농약 시료에 적용하여 회수율 시험을 수행하였다. 즉, 마쇄한 대표 농산물 무농약 시료 각 25 g에 정량한계, 정량한계의 10배, 50배 및 100배에 해당하는 phosphamidon 표준용액을 각각 3반복으로 처리한 다음 상기 분석과정을 수행하여 회수율과 분석오차를 측정하였다.

    결과 및 고찰

    1. GC-NPD 분석조건의 확립

    Phosphamidon은 분자 내 acryloyl group(prop-2-enoyl)의 C=C 이중결합이 각각 E- 및 Z-configuration을 이루는 cis-trans isomer의 혼합물이며, 잔류량은 두 isomer의 총량으로 계산한다(Lee, 2017). GC-NPD를 이용한 phosphamidon 분석 의 최적 column을 선정하기 위해 칼럼 충진제의 극성을 달리 하여, 즉 phenylsiloxane/methylsiloxane 함량별로 극성이 다른 분리용 칼럼을 이용하여 분리능을 조사한 결과, methylsiloxane 이 각각 100% 및 95% 함유된 DB-1 및 DB-5의 비극성 계 열 column 보다 methylsiloxane 함유량이 50%로 상대적으로 극성 화합물 분리에 사용빈도가 높은 DB-17 column에서 phosphamidon의 E- 및 Z-이성질체가 모두 sharp한 대칭형 peak를 나타내며, 우수한 양상으로 분리 및 검출되는 양상을 확인할 수 있었고, 또한 열분해나 흡착 등의 현상은 관찰되지 않았다. 따라서 phosphamidon은 log Pow가 0.79로 알려져 있 는 극성 비해리성 화합물임을 고려하여 분석을 위한 최적의 분리용 칼럼은 DB-17으로 선정하였다(Fig. 2). Phosphamidon 성분을 DB-17 column을 이용하여 분석할 때 E- 및 Z-이성질 체의 peak는 면적대비 1 : 9의 비율로 혼재된 양상을 확인할 수 있었으며, 각 이성체의 머무름 시간은 E-isomer는 5.68분, Z-isomer는 7.57분을 나타내었다. GC 분석 시 분리능과 감도 를 증진시키기 위하여 온도구배법을 사용할 수도 있으나, 이 경우 재현성이 등온조건에 비하여 열등한 단점이 있다. 따라 서 본 분석법의 개발 목적은 정밀성 및 재현성, 아울러 단시 간 내에 분석 작업이 수행되어야 하는 일상적 공정 분석을 목 적으로 하므로 분석결과의 재현성 및 안정성 측면에서 보다 유리한 등온조건을 선정하였다.

    기기분석 시 검출한계는 크로마토그램에서 peak로 검출할 수 있는 한계농도를 의미하는데, 크로마토그램 상에서 S/ N(signal/noise)비가 3이상을 나타내는 성분의 농도로 정의되나 신뢰성이 떨어지므로 검출 유무만을 판정하며 명확한 수치화 는 어렵다. 한편, 정량한계는 크로마토그램의 해석 시 신뢰성 이 확보되어 분석결과를 수치화할 수 있는 한계농도로써, 크 로마토그램 상에서 검출된 peak의 S/N의 비가 10 이상(검출 한계의 3배 이상)을 나타내는 성분의 농도를 의미한다 (Armbruster et al., 1994;Fong et al., 1999;Miller, 2005). Table 1의 GC-NPD 조건에서 phosphamidon 표준용액을 분석 하여 S/N비를 계산한 결과, 기기상의 정량한계(S/N≥10)는 E-isomer의 경우 0.5 ng, Z-isomer는 0.05 ng 수준이었다. 한편, 기기분석의 재현성 및 안정성 평가를 위해 0.5 mg/L 농도의 표준용액을 15번 반복 주입 분석하여 머무름 시간 및 peak 면적의 변이계수(CV, %)를 조사한 결과, 두 크로마토그래피 척도 모두에서 최대 3.1% 미만의 오차를 나타내어 기기분석 시 안정적이고 재현성 있는 분석을 수행할 수 있음을 확인하 였다(Table 3).

    한편, phosphamidon의 농도별 표준용액(0.005~2 mg/L) 1 μL를 GC-NPD에 주입, 분석하여 얻은 검량선의 회귀방정식은 E-isomer의 경우 y = 399.58x + 0.732(R2=0.999**), Z-isomer는 y = 3,413.9x- 0.8696(R2=0.999**)으로 모두 우수한 직선성을 나타내었다(Fig. 3). 즉, phosphamidon은 Z-isomer 기준으로 기기 정량한계의 1/10 수준인 0.005 ng에서부터 그 400배인 2 ng까지의 표준검량선에 대한 회귀계수가 R2=0.999** 이상으 로 정량의 직선성이 검정되었으므로 광범위한 농도 범위의 시 료 중 잔류량을 비례적으로 산출하는 것이 가능하였다.

    2. 시료 중 phosphamidon의 추출 및 분배

    농산물 시료로부터 phosphamidon 성분을 추출하기 위한 용 매로는 acetone을 사용하였다. 농산물 추출액으로부터 phosphamidon과 함께 추출되는 방해물질을 1차적으로 제거하 기 위한 조정제법으로는 수용성 유기용매 추출액을 다량의 포 화식염수/증류수로 희석한 후 직접 비극성 용매로 분배 추출 하는 액-액 분배법을 사용하였다. 이 방법은 US FDA법이나 AOAC법에서 보편적으로 사용되며, 번거로운 추출액의 농축 과정을 생략할 수 있는 장점이 있다(AOAC, 2000;Choung, 2019). 액-액 분배의 분배용매로는 n-hexane, 2종의 n-hexane/ dichloromethane 혼합액, dichloromethane 등 4종을 공시하여 phosphamidon의 분배효율을 조사하였다(Table 4). 그 결과, n-hexane 용액 100 mL로 분배하였을 때 phosphamidon의 이성 질체 모두 전혀 회수되지 않았으며, n-hexane/dichloromethane 혼합액(80/20, v/v) 100 mL로 분배하였을 때 E- 및 Z-이성질 체는 평균 26.4% 수준, n-hexane/dichloromethane 혼합액(20/80, v/v) 100 mL로 분배하였을 때 평균 94.3%, dichloromethane 50 mL로 2회 반복하여 분배하였을 때 회수율은 평균 103.7% 를 나타내어 대상 농약이 극성화합물이라는 특성에 맞게 분배 용매의 극성이 높아질수록 회수율이 높아짐을 확인하였다.

    위의 결과와 phosphamidon이 높은 극성을 나타내는 점을 감안하여 수용성 유기용매 추출액을 포화식염수와 다량의 증 류수로 희석한 후 농축과정 없이 직접 비극성 용매인 n-hexane으로 1차 분배하였을 경우 phosphamidon이 전혀 회수 되지 않는 점에 착안하여 n-hexane으로 1차 분배하여 유지 혹 은 비극성 물질을 제거하고, 잔류액을 다시 dichloromethane으 로 2차 분배할 경우 phosphamidon의 손실 없이 유지 혹은 비극성 성분의 완전한 제거가 가능하리라 판단되어 추가적으 로 용매 분배법을 검토하였다. 즉, 현미 및 콩 시료와 같이 지질이 다량 함유된 시료의 경우 추출 시 혼입되는 농산물 유 래 상당량의 비극성 및 유지성분을 제거하기 위해 수용성 유 기용매 분배 후 이들 유지성분 및 비극성 물질을 제거하기 위 해 n-hexane/acetonitrile 분배법을 추가 적용하는 경우가 일반 적이지만(Choung, 2019), 본 연구에서는 대상 성분인 phosphamidon이 극성화합물이라는 점과 n-hexane 분배 시 phosphamidon의 손실이 전혀 발생하지 않는다는 점을 고려하 여, 먼저 1차적으로 n-hexane 분배를 통해 농산물 시료로 부 터 유래하는 비극성 및 유지성분을 먼저 제거하고, 이후 연속 하여 phosphamidon을 회수하는 방법이 가능하리라 판단하였 으며, 이 경우 일반적으로 수용성 유기용매 분배 후 유지성분 의 제거를 위해 사용되는 n-hexane/acetonitrile 분배법을 생략 할 수 있는 장점이 있을 것이다. 따라서 분획용매 V의 조건에 서는 분획용매 I의 조건인 n-hexane으로 1차 분배하고, 남은 잔류액에 분획용매 IV의 조건으로 2차 분배하였을 경우의 회 수율을 검토한 것으로, phosphamidon의 E- 및 Z-이성질체가 평균 100.5% 수준으로 회수되는 양상을 나타내어 우수한 분 배양상을 확인할 수 있었으므로, 분배용매 V의 조건을 최종 phosphamidon의 액-액 분배용매 조건으로 선정하였다.

    3. Silica gel 흡착 크로마토그래피 조건의 최적화

    농산물에 함유된 phosphamidon의 분석 시 상기 액-액 분배 과정을 통해 상당량의 불순물 및 비극성 간섭물질들이 제거되 었을 것으로 판단되나, 농산물에 따라 시료로부터 유래되는 다 양한 기타 불순물이 존재하므로, 추가적인 정제과정이 필요할 것으로 판단되어 흡착크로마토그래피에 의한 정제법을 검토하 였다. 흡착크로마토그래피는 잔류농약 분석 시 가장 많이 이 용하는 방법으로, 흡착제로는 silica gel, florisil 및 alumina 등이 많이 사용된다. 이 중 silica gel은 각종 성분 및 지방의 흡착능이 뛰어나 미국의 FDA(1999)AOAC(2000) 등에서 가장 많이 사용하는 방법 중 하나이다. 본 연구에서도 phosphamidon의 극성을 고려하여 silica gel을 흡착제로 선정 하였으며, 용매의 극성 조절을 위해 dichloromethane/acetone 혼합용액의 용매체계를 사용하여 최적화 하였다(Table 5). Silica gel 흡착크로마토그래피용 이동상 용매의 극성을 조절하 여 phosphamidon의 회수율을 조사한 결과, dichloromethane/ acetone 혼합액(90/10, v/v) 100 mL로 pre-washing한 후, dichloromethane/acetone 혼합액(80/20, v/v) 150 mL로 용출할 경우 phosphamidon 성분의 E- 및 Z-이성질체 회수율이 평균 95.7%를 나타내어 검토된 용매체계 중 가장 우수한 회수율을 나타내었으므로 간섭물질 제거를 위한 추가적인 정제법으로 silica gel 흡착크로마토그래피법을 적용하였다.

    4. 농산물 시료 중 phosphamidon의 분석 정량한계 및 회수율

    본 연구에서 확립한 phosphamidon의 분석을 위한 추출, 정제 및 기기분석 과정을 무농약 농산물 시료에 적용한 결과는 Fig. 4와 같다. 무농약 농산물의 최종 시료용액에서 phosphamidon과 동일한 머무름 시간에 간섭물질이 존재하지 않음을 확인하였 고, 분석기기의 정량한계(LOQ)와 시료량, 그리고 분석과정 중 의 농축배율을 계상하여 분석법의 정량한계를 산출하였다. 무 농약 농산물 시료에서 간섭물질이 존재하지 않음을 확인한 후 산출된 phosphamidon의 정량한계는 Z-isomer 기준 0.02mg/kg 이었으며, 국제기준인 Codex Alimentarius Commission(2003) 및 식품공전 잔류농약분석법 실무 해설서(Lee, 2017)에서 권 장하는 잔류농약분석법 기준인 0.05 mg/kg 이하 또는 허용기 준의 1/2 이하의 정량한계 기준에 적합하였다. 각각의 농산물 무처리 시료에 phosphamidon 표준용액을 정량한계, 정량한계 의 10배, 50배 및 100배의 농도가 되도록 인위 첨가하고, 상 기 확립된 분석방법에 의하여 대표 농산물을 3반복으로 분석 하여 회수율을 조사한 결과, 정량한계 수준에서는 E- 및 Z-이 성질체 회수율이 평균 87.3~100.0%, 정량한계 10배 수준에서 는 평균 90.1~100.7%, 정량한계 50배 수준에서는 평균 88.0~100.5%이었으며, 정량한계의 100배 수준에서는 평균 84.9~94.9%의 양호한 회수율을 보였고, 재현성도 양호하여 분 석오차는 최대 4.9%로 조사되었다. 따라서, 처리수준 및 농산 물 시료 종류에 관계없이 잔류분석 기준인 회수율 70~120% 범위와 분석오차 10% 이내를 만족하였다(Table 6). 이상의 결 과에서 볼 때, 본 연구에서 확립한 phosphamidon의 분석법은 국내 사용금지 고독성 유기인계 살충제 phosphamidon의 정확 성 및 정밀성이 확보된 단성분 정량분석법으로 국내·외 수출 입 및 유통 농산물 잔류농약 검사에 충분히 적용 가능함을 확 인하였다.

    5. GC/MS를 이용한 잔류분의 재확인

    최종 확립된 phosphamidon 분석법의 신뢰성을 확보하기 위 해 GC/MS에 의한 재확인 과정을 추가하였다. Narrow bore capillary column을 사용하여 phosphamidon 표준용액을 주입 하여 Fig. 5와 같이 GC/MS의 total-ion chromatogram(TIC) 을 얻었다. TIC로부터 EI spectrum(Fig. 6)을 검토한 결과, [M]+ ion인 299.1 m/z는 intensity가 낮아 관찰되지 않았으나, [M-Cl]+ ion인 264.0 m/z, [M-N(C2H5)2]+ ion인 226.9 m/z, [M-Cl-NC4H9]+ ion 193.0 m/z 및 [M-Cl-(CH3O)2P(OH)2]+ ion 138.0 m/z는 충분한 intensity로 관찰되었으며, [(CH3O)2P(OH)2]+ ion인 127.0 m/z가 base peak로 나타나는 특성이 잘 반영되어 phosphamidon의 분자구조를 EI spectrum을 통해 명확히 확인 할 수 있었다. Fig. 7은 본 실험에 사용된 대표 농산물 시료 중 현미를 대상으로 phosphamidon의 잔류분을 재확인한 selected-ion monitoring(SIM) chromatogram이며, 본 실험에 사용된 모든 농산물의 무처리 시료에서는 대상 농약성분의 peak가 전혀 관찰되지 않았고, 인위 첨가된 시료에서는 동일 한 머무름 시간대에 정확하게 phosphamidon의 잔류분만을 확 인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 사용한 GC/MS의 SIM 조건을 이용할 경우 GC-NPD를 이용한 정량법과 더불어 phosphamidon 잔류분의 추가적 정성분석법으로 사용할 수 있 을 것으로 판단된다.

    적 요

    본 연구에서는 GC-NPD/MS를 이용하여 농산물 중 국내 사 용금지 고독성 유기인계 살충제 phosphamidon의 잔류 분석법 을 확립하였다. 대표 농산물은 배추, 고추, 감귤, 현미 및 콩을 사용하였고, acetone으로 추출된 phosphamidon은 n-hexane 및 dichloromethane 액-액 분배법을 순차적으로 이용하고 silica gel 흡착크로마토그래피법으로 정제하여 GC-NPD/MS 의 분 석시료로 사용하였다. Phosphamidon의 정량분석을 위한 최적 GC-NPD 분석조건을 확립하였으며, 정량한계(LOQ)는 0.02 mg/kg 이었다. 각 대표 농산물에 대해 정량한계, 정량한계의 10배, 50배 및 100배 수준에서 회수율을 검토한 결과, 모든 처리농도에서 84.9~100.7% 수준의 회수율을 나타내었으며, 반 복 간 변이계수(CV)는 최대 4.9%를 나타내어 잔류분석 기준 인 회수율 70~120% 및 분석오차 10% 이내를 충족시키는 만 족한 결과를 도출하였으며, GC/MS SIM을 이용하여 실제 농 산물 시료에 적용하여 재확인 하였다. 이상의 결과로 신규 phosphamidon의 GC-NPD/MS 분석법은 검출한계, 회수율 및 분석오차 면에서 국제적 분석기준을 만족하는 신뢰성이 확보 된 정량분석법으로 사용 가능할 것이다.

    Figure

    KSIA-31-3-240_F1.gif

    Chemical structures of phosphamidon.

    KSIA-31-3-240_F2.gif

    GC-NPD chromatogram of phosphamidon using DB-17 capillary column(1 μL of 0.1 mg/L in acetone).

    KSIA-31-3-240_F3.gif

    Calibration curves of phosphamidon using GC-NPD.

    KSIA-31-3-240_F4.gif

    GC-NPD chromatograms of typical agricultural commodity extracts for the analysis of phosphamidon, fortified at ten-fold of LOQ level.

    KSIA-31-3-240_F5.gif

    Total-ion chromatogram(TIC) of phosphamidon using GC/ MS.

    KSIA-31-3-240_F6.gif

    EI mass spectrum of phosphamidon.

    KSIA-31-3-240_F7.gif

    SIM chromatograms of hulled rice extract for the confirmation of phosphamidon, fortified at ten-fold of LOQ level.

    Table

    GC-NPD operating parameters for the analysis of phosphamidon

    GC-MS operating parameters for the confirmation of phosphamidon

    Reproducibility of peak area and retention time of phosphamidon using GC-NPD

    Efficiency of liquid-liquid partition of crude extract by different solvents for phosphamidon

    Elution profile of phosphamidon on silica gel column chromatography

    Recovery rates of phosphamidon with different agricultural commodity samples

    Reference

    1. AOAC.2000. Pesticide and industrial chemical residues, In Official method of analysis, pp. 1-88. 17th ed. Arlington, USA.
    2. Armbruster, D.A. , Tillman, M.D. , & Hubbs, L.M. 1994. Limit of detection(LQD)/limit of quantitation(LOQ): comparison of the empirical and the statistical methods exemplified with GC-MS assays of abused drugs, Clinical Chemistry 40: 1233-1238.
    3. Choung, M.G. 2019. Development of analytical method for valinamide carbamate fungicide iprovalicarb residue, Journal of the Korean Society of International Agriculture 31(1): 25-33.
    4. Codex Alimentarius Commission.2003. Guidelines on Good Laboratory Practice in Residue Analysis, CAC/GL 40-1993, Rev.1-2003, Rome, Italy.
    5. Fong, W.G , Moye, H.A. , Seiber, J.N. , & Toth, J.P. 1999. Pesticide residues in food: Methods, technologies and regulations, pp. 3-4, 40-44, Canada.
    6. Fritz, B. 1960. Phosphamidon, a new phosphate ester with systemic action, Proceedings of International Conference on Crop Protection 2: 1153-1155.
    7. Hong, S.Y. , Gil, H.W. , Yang, J.O. , & Lee, E.Y. 2005. Effect of dialysis and perfusion on phosphamidon in vitro, Journal of Korean Society of Clinical Toxicology 3(1): 17-21.
    8. Kim, J.B. , Song, B.H. , Jeon, J.C. , Lim, G.J. , & Lim, Y.B. 1997. Effects of sprayable formulations on pesticide adhesion and persistence in several crops, The Korean Society of Pesticide Science 1(1): 35-40.
    9. Korea Crop Protection Association.2015. Using guideline of crop protection agents, p. 731, Seoul, Korea.
    10. Kwon, C.H. , & Lee, Y.D. 2003. Terminal residues of monocrotophos and phosphamidon in apples, Life Science Research 1(3): 277-286.
    11. Lee, Y.D. 2017. Pesticide analytical residues manual in food code, Ministry of Food and Drug Safety, Seoul, Korea.
    12. Miller, J.M. 2005. Chromatography: Concepts and contrasts. pp. 286- 287. 2nd ed. USA.
    13. Ministry of Food and Drug Safety.2017a. Korea Food Code, Seoul, Korea.
    14. Ministry of Food and Drug Safety.2017b. MRLs for pesticides in foods, pp. 141-142, Seoul, Korea.
    15. Roberts, T. , & Hutson, D. 1999. Insecticides and Fungicides, Metabolic pathways of agrochemicals, p. 442. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK.
    16. US EPA.2009. Acute exposure guideline levels(AEGLs) for phosphamidon, US Environmental Protection Agency, Washington D.C., USA.
    17. US EPA.1999. Pesticide Analytical Manual, Vol 1: Multi-residue Methods(3rd ed.), US Food and Drug Administration, Silver Spring, MD, USA.