Journal Search Engine
Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.30 No.4 pp.339-346
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2018.30.4.339

Development of Individual Residue Analysis Method for Cyanazine in Agricultural Commodities as an Unregistered Herbicide in Korea

Myoung-Gun Choung*, Moo-Hyeog Im**
*Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University, Samcheok 25949, Korea.
**Department of Food Engineering, Daegu University, Gyeongbuk 38453, Korea.
Corresponding author : (Phone) +82-53-850-6537 (E-mail) imh0119@daegu.ac.kr
November 13, 2018 December 12, 2018 December 13, 2018

Abstract


Cyanazine is a member of the triazine family of herbicides. Cyanazine is used as a pre- and post-emergence herbicide for the control of annual grasses and broadleaf weeds. This experiment was conducted to establish a determination method for cyanazine, as domestic unregistered pesticide, residue in major agricultural commodities using HPLC-DAD/MS. Cyanazine was extracted with acetone from representative samples of five raw products which comprised apple, green pepper, Kimchi cabbage, hulled rice and soybean. The extract was diluted with saline water and partitioned to dichloromethane for remove polar extractive in the aqueous phase. For the hulled rice and soybean samples, n-hexane/acetonitrile partition was additionally employed to remove non-polar lipids. The extract was finally purified by optimized florisil column chromatography. On a C18 column in HPLC, cyanazine was successfully separated from co-extractives of sample, and sensitively quantitated by diode array detection at 220 nm. Accuracy and precision of the proposed method was validated by the recovery experiment on every major agricultural commodity samples fortified with cyanazine at 3 concentration levels per agricultural commodity in each triplication. Mean recoveries were ranged from 83.6 to 93.3% in five major representative agricultural commodities. The coefficients of variation were all less than 10%, irrespective of sample types and fortification levels. Limit of quantitation(LOQ) of cyanazine was 0.02 mg/kg as verified by the recovery experiment. A confirmatory method using LC/MS with selected-ion monitoring(SIM) technique was also provided to clearly identify the suspected residue.



국내 미등록 제초제 cyanazine의 농산물 중 개별 잔류분석법 개발

정 명근*, 임 무혁**
*강원대학교 생약자원개발학과
**대구대학교 식품공학과

초록


    서 언

    농업 현장에서 농약의 사용은 노동력 감소, 농작물 보호 및 생산량 증대와 더불어 고품질 농산물 생산의 필수적 요소이므 로, 농약 사용에 따른 농식품의 안전성 확보는 매우 중요한 과 제일 것이다(Park et al., 2011). 최근 Free Trade Agreement (FTA) 체결로 인해 농산물의 수·출입이 활발하게 이루어지고 있으나, 농약 잔류허용기준이 설정 되지 않은 농산물이 수·출 입 될 경우, 부적합 농산물이 양산되어 국민들을 불안하게 할 수 있을 것이므로 국내 생산 농식품에 함유된 농약 및 수입 식품에 함유된 농약에 대해서도 국민적 관심이 증대되고 있는 실정이다(Lee et al., 2011 a). 국내 미등록 농약이나, 아직 국 내 분석법이 확립되지 않은 특정 농약에 대해서는 수입 농식 품에 대상 농약이 잔류하여도 잔류농약 검사에서 대상 성분이 검출되지 않을 수 있으므로 국내에서는 등록되지 않은 농약이 지만 국외에서의 사용빈도가 높은 농약일 경우 국내 실정에 맞 는 분석체계를 확립하여 수입 농식품의 안전성 확보를 기하는 것이 중요할 것이다(Lee et al., 2010).

    국내 미등록 triazine계 제초제 cyanazine은 옥수수, 목화, 수수, 가을밀 및 휴한작물 등의 광엽잡초를 제거하는 데 사용 되며(Lynch et al., 2006), 중국의 경우 옥수수 등을 포함한 다양한 밭작물에 사용하고, Maximum Residue Limit (MRL) 은 0.05 mg/kg 수준이며(Meador & Jie, 2014), 뉴질랜드의 경우 콩, 완두콩, 양파, 감자 및 옥수수 등 다양한 작물에 사용 하며, MRL은 0.01~0.02 mg/kg 수준이다(NewZealand Food Safety Authority, 2007).

    Cyanazine의 물리화학적 특성 및 화학구조를 표 1에 나타내 었으며 무색, 무취의 결정체로, 다양한 유기용매와 물에도 모 두 잘 용해되는 특성을 나타낸다(WHO, 2003).

    Triazine계 농약은 분자 구조 내 triazine ring과 염소기를 포함하는 경우가 많으므로 gas chromatography/nitrogen phosphorous detector (GC/NPD) 혹은 gas chromatography/ electron capture detector (GC/ECD)를 주로 사용하고, 최근에 는 수백종의 농약을 동시에 분석하기 위해 gas chromatography/ mass spectrometry (GC/MS) 방법을 적용하기도 한다.

    한편, cyanazine은 증기압이 2.1 × 10-4mPa를 나타내어 휘발 성이 극히 낮고, 아울러 triazine ring에 결합된 염소 원자의 취약성, amino기의 해리성 등으로 인하여 GC 분석 중 흡착 및 열분해 현상이 일어나므로 재현성이 불량하다. 또한, Log Pow 값이 2.2로 극성이 다소 높은 편이므로 GLC 분석 중 backward tailing 현상이 발생할 수 있고, 검체 주입 시 마다 peak의 재현성도 불량할 가능성이 많다. 따라서 분리용 column을 충분히 conditioning하고 표준 용액을 검체용액과 교 대로 주입, 보정하여야 최상의 분석 재현성을 얻을 수 있다 (Lee, 2017).

    국외에서 보고된 cyanazine의 분석법의 경우 분자구조 내에 함유되어 있는 amino기의 해리성과 낮은 휘발성으로 인해 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Sănchez- Razero & Dios, 1988;Hogendoorn & Goewie, 1989) 혹은 분광광도계를 이용한 비색 분석법이 보고된 바 있고(Zhang & Pan, 2011), 국내의 경우 식품공전 7.1.2.2법인 다종농약 다성 분 분석법 제2법에서 GC-ECD 및 MS/MS 분석법을 기재하 고 있다(Ministry of Food and Drug Safety, 2017). 그러나 이 분석법은 cyanazine의 물리화학적 특성을 고려할 때 최적 화된 분석법으로 보기 어려우며, 아울러 다종농약 다성분 분 석법의 경우 농약 살포내역이 불분명한 미지 식품검체에 대하 여 잔류농약의 함유 여부를 검색 (screening) 할 목적으로 사 용되는 분석법이다. 다종농약 다성분 분석법은 분석조작 1회 당 검색이 가능한 농약수가 수백종으로 분석효율은 매우 높으 나 각각의 성분에 대한 정밀도나 신뢰성은 열등하다. 즉 다종 농약 다성분 분석법에서는 대상성분들을 물리화학적 특성 범 위별로 크게 그룹핑하고 그룹별로 검체 추출, 정제 및 기기분 석과정에 의하여 검체 분석을 수행하므로 1개 분석 대상 성분 마다 최적의 분석법을 적용하는 것이 불가능하다. 따라서 각 대상성분의 특성에 최적화된 검체 추출, 정제 및 기기분석조 건이 적용 되는 개별 분석법에 비하여 분석 감도, 정밀성 및 신뢰도가 극히 떨어지는 양상을 보인다. 또한 정제과정이 특 화되어 있지 않아 간섭물질의 제거범위가 개별 분석법에 비하 여 좁으므로 검체의 종류별로 혼입되는 간섭물질의 종류 및 양이 크게 변화할 수 있다. 즉, 검체 종류별로 분석 성분들에 대하여 간섭 정도가 상이하므로 크로마토그래피적 머무름 특 성만을 이용하여 확인된 분석 성분의 정성적 확률이 열등하 다. 따라서 다종농약 다성분 분석법에 의하여 검출된 성분에 대해서는 반드시 재확인과정을 수행하여야 할 것이다. 특히 허 용기준 등에 근접한 잔류량을 나타내어 실험적 오차 등이 법 적 판정에 영향을 미치는 경우에는, 동일 검체에 대하여 검출 된 성분에 특화된 개별 분석법을 재적용, 추가 분석함으로써 분석결과의 정밀성을 입증하여야 한다(Lee, 2017).

    또한, 현재 보고된 대부분의 선행 연구결과들은 모두 분석 대상이 토양 혹은 지하수에 대한 잔류성 및 오염도를 평가하 기 위해 이루어진 실험의 결과들이며, 실제 농산물을 대상으 로 한 분석조건 확립 및 회수율 등이 검토된 결과는 극히 미 비한 실정이다. 따라서 본 연구는 국내 미등록 농약이지만 중 국과 뉴질랜드 등 국외에서 광엽잡초의 제초를 목적으로 사용 되고 있는 triazine계 제초제 cyanazine에 대해 정확성 및 정 밀성이 확보되고, 농산물에 적용 가능한 신규 단성분 분석체 계를 검토하여 국내외 식품 검역 및 재배 작물의 잔류농약 검 사를 위한 기초 자료를 제공하고자 한다.

    재료 및 방법

    시약 및 기구

    Cyanazine의 분석용 표준품은 순도 98.0% 이상인 Sigmaaldrich (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하여 사용하였다. 표준품의 stock solution은 methanol에 용해하여 500 mg/L의 농도가 되도록 조제하여 -20°C의 냉동고에서 보관하였으며, 필 요 시 methanol로 희석하여 사용하였다. 정제에 사용된 흡착 크로마토그라피용 florisil (60~100 mesh)은 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)사로부터 구입하였고, 130oC에서 12시 간 이상 연속 가열 후 활성화된 상태에서 사용하였다. 또한 분석에 사용된 유기용매로서 n-hexane, dichloromethane, acetone, methanol, acetonitrile 및 ethyl acetate는 잔류분석용 을, deionized water는 HPLC용을 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였다. 기타 유기용매 및 무기시약은 시 약특급 혹은 잔류분석용을 구입하여 사용하였다. 각종 분석용 매의 감압농축에는 회전증발 농축기(Eyela NE-1000SW, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 시료의 마쇄 및 균질화는 고속 호모게나이저(IKA, Ultra-Turrax T-25, Wilmington, NC, USA)를 이용하였다.

    주요 농산물 시료

    본 연구에 사용된 주요 농산물은 곡류 중 현미, 두류는 콩, 채소류는 고추 및 배추, 과일류에서는 사과를 선정하였다. 각 농산물의 무농약 시료는 지역 대형마트에서 유기농 인증시료 를 구입한 후 식품공전 상 검체 처리방법(Ministry of Food and Drug Safety, 2017)에 따라 전처리하여 사용하였다. 대조 시료는 자체적으로 대상농약에 대해 잔류검사를 실시하여 무 농약 시료임을 검증한 후 사용하였다. Table 1

    HPLC-DAD/MS 분석

    Cyanazine은 구조적으로 결합된 amino기로 인해 Gas chromatography (GC) 분석 시 열분해가 발생할 수 있어 분리 능이 열악해질 수 있으므로(Hwang et al., 2016), 본 연구에 서도 HPLC/DAD 분석법을 적용하였다. HPLC는 Agilent (Wilmington, DE, USA) 1200 series를 이용하였고, 분리용 칼럼은 YMC-Pack Pro C18 RS(4.6 × 250 mm, 5 μm, Waters, Milford, MA, USA)를 사용하였으며, 잔류분 재확인용 liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS)는 Agilent (Wilmington, DE, USA) 6110 모델을 사용하였다(Table 23).

    검량선, 재현성 및 정량한계(Limit of quantitation, LOQ)

    Cyanazine 표준용액 0.05~5.0 mg/L를 각 20 μL씩 HPLCDAD에 주입 분석하여 계산된 peak 면적을 기준으로 표준용 액의 검량선을 작성하였다. 또한, 분석기기의 재현성 (reproducibility)을 검증하기 위해 0.5 mg/L의 cyanazine 표준 용액을 HPLC-DAD에 10회 연속 주입, 크로마토그램 상의 retention time(tR) 및 peak area 등의 변이를 비교 평가하였다.

    분석 정량한계는 대조 농산물 시료에서 간섭물질이 존재하 지 않음을 확인하고, 분석기기의 정량한계, 시료 주입량, 시료 사용량 및 최종 회수된 시료 용액의 양을 계산하여 아래의 계 산식에 의해 산출하였으며(Lee et al., 2011 b), 동일 수준으 로 cyanazine을 처리한 주요 농산물의 회수율을 확인하였다.

    정량한계 (mg/kg) = [기기 정량한계(ng) / 주입량(μL)] × [시료용액(mL) / 시료량(g)]

    추출 및 액-액 분배

    농산물 시료 25 g에 아세톤 100 mL를 가하고(콩 및 현미 시료의 경우 추출 전 20 mL의 증류수를 가한 후 30분간 방 치하여 미리 습윤화 함) 호모게나이저 상에서 2분간 고속마쇄 추출하였다. 추출물을 여과지(Toyo No. 6, Japan)가 장착된 부흐너 여과기에서 감압여과하고 시료 및 호모게나이저 컵을 여분의 아세톤 40 mL로 씻고 여과액을 합하였다. 여과 추출 액을 1 L 용량의 분액깔대기로 옮기고 포화식염수 50 mL 및 증류수 450 mL를 첨가한 뒤 50 mL의 dichloromethane으로 2 회 분배 추출하였다. Dichloromethane 추출액을 무수 황산나 트륨으로 탈수한 후 40°C에서 감압 농축하였다. 현미와 콩을 제외한 나머지 시료는 감압농축 후 dichloromethane 10 mL에 용해하여 florisil 흡착 크로마토그래피에 공시하였고, 현미와 콩의 경우 미리 acetonitrile로 포화시킨 n-hexane 40 mL에 재 용해하여 250 mL 용량의 분액깔대기로 옮기고 n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile 40 mL로 2회 분배 추출하였다. 합쳐친 acetonitrile 추출액을 40°C에서 감압 농축하고, 농축 후 건고물 을 10 mL의 dichloromethane으로 용해하여 florisil 흡착 크 로마토그래피에 공시하였다.

    흡착크로마토그래피 정제

    내경 1.5 cm 및 길이 40 cm의 유리칼럼에 미리 활성화시 켜 둔 florisil 10 g을 건식방법으로 충전하고, 그 위에 3 g 의 무수 황산나트륨을 추가로 충전하였다. 충전된 유리칼럼 에 50 mL의 n-hexane 용액을 첨가하여 흘린 후 상단에 소량의 n-hexane이 남을 정도로 유출시키고, 계속하여 10 mL의 dichloromethane에 용해된 시료액을 가하고 약 3 mL/min의 유속으로 유출시켰다. 충전제 표면이 노출되기 직 전 n-hexane/ethyl acetate 혼합용액(95/5, v/v) 150 mL를 용 출시켜 칼럼을 세척하고, 계속하여 n-hexane/ethyl acetate 혼 합용액(85/15, v/v) 150 mL로 cyanazine 성분을 회수하였으며, 40oC에서 감압 농축 및 건고하고, 농축수기에 잔류하는 잔류물 을 10 mL의 water/acetonitrile(60/40, v/v)에 용해하여 HPLCDAD로 분석하였다.

    Cyanazine의 회수율 검증s

    본 연구에서 확립된 cyanazine 분석법을 검증하기 위하여 실제 농산물 시료를 대상으로 회수율 검증 실험을 수행하였다. 마쇄 혹은 분쇄한 각 무농약 대표 농산물 시료 25 g에 정량한 계, 정량한계의 10배 및 50배에 해당하는 cyanazine 표준용액 을 3반복으로 인위 첨가한 후 상기의 분석과정을 수행하고 회 수율과 분석오차를 검증하였다.

    결과 및 고찰

    HPLC-DAD 분석조건

    본 연구의 대상성분인 cyanazine의 HPLC-DAD 검출파장을 선정하기 위하여 메탄올에 용해된 5 mg/L의 표준품을 이용하 여 190~400 nm에서 최대흡수파장(λ max)을 조사하였다. 그 결과 cyanazine의 최대흡수파장은 220 nm에서 최대 흡광력을 나타내어 220 nm를 최적의 검출파장으로 선정하였다(Fig. 1). 분리용 HPLC column은 YMC-Pack Pro C18 RS(4.6 × 250 mm, 5 μm)를 이용하였으며, 이동상 용액은 water/acetonitrile (60/40, v/v) 혼합용액을 등용매용리(isocratic elution) 조건으로 사용하였고, cyanazine의 머무름시간은 11.1분 수준이었다.

    Table 2의 HPLC-DAD 조건에서 cyanazine 표준용액의 S/ N(signal/noise) 비율을 검토한 결과 기기 정량한계(S/N≥10)는 1 ng 수준이었다. 한편, 기기분석의 안정성 및 분석 재현성 평 가를 위해 0.5 mg/L 농도의 cyanazine 표준용액을 10번 반복 주입하여 머무름시간 및 peak area의 변이계수(CV, %)를 조 사한 결과 두 크로마토그래피 척도 모두 최대 1.10% 미만의 오차범위를 나타내어 기기 분석시 안정적이고 재현성 있는 분 석을 수행할 수 있음을 확인하였다(Table 4). Fig. 2

    한편, 0.05~5 mg/L 범위의 cyanazine 농도별 표준용액 20 μL를 HPLC에 주입하여 얻은 검량식의 회귀방정식은 y = 134.9198x-0.3724(R2=0.999**)로 우수한 직선성을 나타내었다 (Fig. 3). 이 결과는 cyanazine의 경우 기기 정량한계 수준인 1 ng에서 부터 그 100배에 해당하는 농도인 100 ng 까지 고 도의 직선성을 나타냄을 확인할 수 있고, 폭넓은 농도 범위의 cyanazine을 비례적으로 산출하는 것이 가능함을 확인하였다.

    추출 및 액-액 분배

    농산물 시료로부터 cyanazine을 추출하기 위한 용매로는 아 세톤을 사용하였고, 아세톤 추출 시 cyanazine과 함께 추출되 는 시료의 메트릭스 성분을 제거하기 위한 1차적 정제법으로 는 액-액 분배법을 사용하였고, 이 방법은 수용성 유기용매 추 출액을 다량의 포화식염수/증류수로 희석한 후 직접 비극성 용 매로 분배 추출하는 방법으로 번거로운 추출액의 농축과정을 생략할 수 있는 장점이 있다(AOAC, 2000;Lee et al., 2008). 액-액 분배의 용매로는 n-hexane, n-hexane/dichloromethane 혼합액 및 dichloromethane 등의 분배 용액을 공시하여 cyanazine의 분배효율을 조사하였다(Table 5). 대상 성분을 100 mL의 n-hexane 용액으로 분배하였을 때 회수율은 7.5% 수준이었으며, 100 mL의 n-hexane/dichloromethane 혼합액 (80/20, v/v)으로 분배하였을 때 회수율은 61.0% 수준, 100 mL의 n-hexane/dichloromethane 혼합액(20/80, v/v)으로 분배 하였을 때는 81.2%, 50 mL의 dichloromethane으로 연속하여 2회 반복 분배한 경우 회수율이 95.0% 수준을 나타내어 공시 된 분배조건 중 가장 우수한 회수율을 나타내었으며, cyanazine의 물리화학적 특성 중 하나인 log pow 값이 2.2로 극성이 다소 높은 편 양상임을 고려할 때 분배용매의 극성이 높아질수록 액-액 분배의 회수율이 높아지는 양상을 확인할 수 있었다.

    Dichloromethane 액-액 분배과정으로 1차적 정제는 가능하 나 일부 시료 중에 포함된 유지 성분은 dichloromethane 층으 로 cyanazine과 함께 분배되기 때문에 제거되지 않을 것이다. 시료에 포함된 유지 성분은 기기분석 시 치명적 간섭, 분리용 column의 분리능 저하 및 기준선의 심각한 변화(baseline shift)를 초래하므로 반드시 제거해야 할 간섭대상 물질이다. 본 연구에서 사용된 시료 중 현미와 콩은 유지가 각각 1~3% 및 20% 수준 함유되어 있는 것으로 평가 되므로, 시료로부터 유래한 유지성분의 효율적 제거를 위하여 n-hexane/acetonitrile 분배법을 추가로 공시하였다(US FDA, 1999;AOAC, 2000). Table 6에 나타낸 바와 같이 미리 n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile로 2회 분배하였을 때 cyanazine은 94.8% 수준으로 회수가 가능하였으며, n-hexane으로 포화시킨 acetonitrile로 3 회 분배하였을 때의 회수율은 94.0%를 나타내어 분배 횟수를 늘려도 회수율이 향상되지 않았으며, 이는 앞에서도 언급한 것 처럼 cyanazine의 log pow 값이 2.2로 극성이 다소 높은 편 임을 고려할 때 비극성 용매인 n-hexane 층으로의 분배는 비 교적 낮게 일어나고, 상대적으로 극성이 높은 acetonitrile 층으 로 분배가 크게 일어나므로, 2회만의 분배를 실시하여도 극성 용매인 acetonitrile 층으로 대부분의 cyanazine이 분배됨을 알 수 있으며, 작업의 편의성을 고려하여 유지 및 비극성 간섭물 질의 제거를 위한 n-hexane/acetonitrile 분배법은 2회 분배로 선정하였다. 한편, 시료에 함유된 유지성분의 함량이 0.1~0.4% 수준으로 평가되는 고추, 배추 및 사과에서는 제거되는 비극 성 유지 성분 및 불순물의 양이 매우 작고 크로마토그램 상에 서 그 정제 효과 또한 미미하므로 n-hexane/acetonitrile 분배 과정을 생략하였다.

    흡착 크로마토그래피 정제

    Cyanazine의 분석 시 상기 액-액 분배과정을 적용할 경우 대부분의 극성 불순물 및 비극성 간섭물질들이 제거될 것으로 판단되나, 농산물에 따라 시료 메트릭스로 부터 유래하는 다 양한 불순물이 존재할 수 있으므로 추가적 정제과정이 필요할 것으로 판단되어 흡착크로마토그래피에 의한 정제법을 추가 검토하였다. 본 연구에서는 florisil을 흡착제로 선정하여 용매 의 극성 조절을 통해 최적화 하였다(Table 7).5

    용출용매의 극성 조절을 이용하여 cyanazine의 회수율을 검 토한 결과, 150 mL의 n-hexane/ethyl acetate 혼합액(95/5, v/ v)으로 florisil 칼럼을 세척한 후, 계속하여 150 mL의 nhexane/ ethyl acetate 혼합액(80/15, v/v)으로 용출할 경우 cyanazine의 회수율이 95.1%를 나타내었으며, 혼합액의 극성 을 높이기 위해 ethyl acetate의 비율을 높여도 회수율은 크게 향상되지 않았다.

    Cyanazine의 정량한계 및 회수율 검증

    Cyanazine 분석을 위해 확립된 시료 추출, 정제 및 기기분 석 과정을 무농약 대표 농산물 시료에 적용한 결과는 Fig. 4 와 같다. 무농약 농산물 시료용액에서 cyanazine과 동일한 머 무름시간을 나타내는 간섭물질은 존재하지 않았으므로, 분석 기기의 정량한계(LOQ)와 시료량, 그리고 분석과정 중의 농축 배율을 계상하여 분석법의 정량한계를 산출하였다. 본 연구에 서 무농약 대표 농산물 시료에서 간섭물질이 존재하지 않음을 확인한 후 산출된 cyanazine의 정량한계는 0.02 mg/kg이었으 며, 국제기준인 Codex Alimentarius Commission(Codex, 2003) 및 식품공전 잔류농약분석법 실무 해설서(Lee, 2017)에 서 권장하는 잔류농약분석법 기준인 0.05 mg/kg 이하 또는 허용기준의 1/2 이하의 정량한계 기준에 적합하였다.

    대표 농산물 무처리 시료에 cyanazine 표준용액을 정량한계, 정량한계의 10배 및 50배의 농도가 되도록 인위 첨가하고, 확 립된 cyanazine 분석법을 이용하여 각 대표 농산물을 3반복으 로 분석하여 회수율을 조사한 결과, 정량한계 수준에서는 86.1~93.3%, 정량한계 10배 수준에서는 83.6~91.4%, 정량한계 50배 수준에서는 83.7~92.2%의 회수율을 나타내었고, 재현성 도 양호하여 분석오차는 최대 2.8%로 조사되었다. 따라서, cyanazine의 처리농도 및 농산물 시료의 종류에 관계없이 국 내 잔류분석기준인 회수율 70~120% 범위와 분석오차 10% 이내를 만족하였고, 아울러 농도별 국제 잔류분석기준(Lee, 2017) 또한 최소 회수율 70~110% 범위와 분석오차 10% 이 내도 만족하였다(Table 8).

    LC/MS를 이용한 cyanazine의 재확인

    본 실험에서 개발된 cyanazine 분석법의 신뢰성을 확보하기 위하여 LC/MS에 의한 재확인 과정을 추가하였다. LC/MS 분 석 시 분석대상 성분의 분자구조로부터 유도되는 분자이온과 주요 fragment ion을 확인함으로써 보다 신뢰성 있는 정성확 인이 가능하다는 장점이 있다(Kwon et al., 2008).

    Cyanazine 성분은 이온화 향상을 위한 추가적인 시약의 첨 가 없이 acetonitrile 수용액의 이동상 용매에서도 이온화가 쉽 게 이루어져 HPLC-DAD 분석에 사용한 이동상 용매 조건을 그대로 LC/MS에 적용하였다. Fig. 56에 나타낸 total-ion chromatogram (TIC) 및 mass spectrum으로부터 cyanazine은 electrospray ionization (ESI) positive ion 조건에서 용이하게 protonation 되어 [M+H]+를 형성하였고, cyanazine의 [M+H]+ peak가 base peak로 나타나므로 selected-ion monitoring (SIM)용 ion으로는 [M+H]+인 m/z=241.0 ion만을 이용하여도 정성적 확인이 가능하였다(Hwang et al., 2016).

    Fig. 7은 본 실험에 사용된 농산물 시료 중 현미를 대상으 로 cyanazine의 잔류분을 재확인한 SIM 크로마토그램이며, 본 실험에 사용된 모든 대표 농산물의 무처리 시료에서는 cyanazine의 peak가 관찰되지 않았고, cyanazine이 인위 첨가 된 시료에서는 동일한 머무름 시간대에 정확하게 cyanazine의 잔류분을 확인할 수 있었다.

    한편 본 실험에서 LC/MS 방법은 재확인 분석법으로 사용 하지만, 농도별 표준용액의 검량식의 직선성을 확인한 결과 0.001~5 mg/L 범위의 cyanazine 농도별 표준용액 5 μL를 HPLC/MS에 주입하여 얻은 검량식의 회귀방정식은 y= 629,711x + 47,780(R2=0.999**)로 역시 우수한 직선성을 나타내 는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 LC/MS의 SIM조건을 이용할 경우에도 HPLC-DAD를 이용한 정량법과 더불어 cyanazine 잔류분의 추가적 정량 혹은 정성분석법으로 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

    적 요

    본 연구는 HPLC-DAD/MS를 이용하여 농산물 중 triazine 계 제초제인 cyanazine의 잔류 분석법을 확립하였다. 대표 농 산물은 사과, 배추, 고추, 현미 및 콩을 선정하였고, 아세톤을 첨가하여 추출된 cyanazine 성분을 dichloromethane 액-액 분 배법과 florisil 흡착크로마토그래피법으로 정제하여 HPLCDAD/ MS 분석대상의 시료로 사용하였다. Cyanazine의 정량적 분석을 위한 최적 HPLC-DAD/MS 분석조건을 확립하였으며, 정량한계(LOQ)는 0.02 mg/kg 이었다. 각 대표 농산물에 대해 정량한계, 정량한계의 10배 및 50배 수준에서 회수율을 검토 한 결과, 모든 처리농도에서 83.6~93.3% 수준을 나타내었으며, 반복 간 변이계수(CV)는 최대 2.8%를 나타내어 잔류분석 기 준인 회수율 70~120% 및 분석오차 10% 이내를 충족시키는 만족한 결과를 도출하였고, 또한 LC/MS SIM을 이용하여 실 제 농산물 시료에 적용하여 재확인 하였다. 이상의 결과로 신 규 cyanazine의 HPLC-DAD/MS 분석법은 검출한계, 회수율 및 분석오차 면에서 국제적 분석기준을 만족하는 신뢰성이 확 보된 정량 분석법으로 사용 가능할 것이다.

    Figure

    KSIA-30-339_F1.gif

    UV spectrum of cyanazine standard solution.

    KSIA-30-339_F2.gif

    HPLC chromatogram of cyanazine standard solution

    KSIA-30-339_F3.gif

    Calibration curve of cyanazine using HPLC-DAD.

    KSIA-30-339_F4.gif

    HPLC chromatograms of hulled rice extract for the analysis of cyanazine.

    KSIA-30-339_F5.gif

    Total-ion chromatogram (TIC) of cyanazine in LC/MS.

    KSIA-30-339_F6.gif

    ESI (positive ion) mass spectrum of cyanazine.

    KSIA-30-339_F7.gif

    SIM chromatograms of hulled rice extract for the confirmation of cyanazine.

    Table

    Physicochemical properties of cyanazine (WHO, 2003)

    HPLC-DAD operating conditions for the analysis of cyanazine

    LC/MS operating conditions for the confirmation of cyanazine

    Reproducibility of peak area and retention time of cyanazine using HPLC

    Efficiency of liquid-liquid partition of crude extract by different solvents for cyanazine

    Efficiency of n-hexane/acetonitrile partition for cyanazine

    Elution profile of cyanazine on florisil column chromatography

    Recovery rates of cyanazine with different agricultural commodities

    Reference

    1. AOAC. 2000. Pesticide and industrial chemical residues, In Official method of analysis, pp. 1-88. 17th ed., AOAC International, Arlington, VA, USA.
    2. Codex Alimentarius Commission. 2003. Guidelines on Good Laboratory Practice in Residue Analysis, CAC/GL 40-1993, Rev.1-2003, Rome, Italy.
    3. Hogendoorn, E.A. , & Goewie, C.E. 1989. Residue analysis of the herbicides cyanazine and bentazone in sugar maize and surface water using high-performance liquid chromatography and an online clean-up column-switching procedure . Journal of Chromatography475: 432- 441.
    4. Hwang, Y.S. , Lim, J.D. , & Choung, M.G. 2016. Analytical method for triazine herbicide cyanazine residues in major medicinal crops . Korean Journal of Medicinal Crop Science14(3): 237-245.
    5. Kwon, C.H. , Chang, M.I. , Im, M.H. , Choi, H. , Jung, D.I. , Lee, S.C. , Yu, J.Y. , Lee, Y.D. , Lee, J.O. , & Hong, M.K. 2008. Determination of mandipropamid residues in agricultural commodities using high-performance liquid chromatography with mass spectrometry . Analytical Science & Technology21(6): 518-525.
    6. Lee, J.H. , Park, H.W. , Keum, Y.S. , Kwon, C.H. , Lee, Y.D. , & Kim, J.H. 2008. Dissipation pattern of boscalid in cucumber under greenhouse condition . Korean Journal of Pesticide Science12(1): 67-73.
    7. Lee, S.J. , Hwang, Y.S. , Kim, Y.H. , Nam, M.Y. , Hong, S.B. , Yun, W.K. , Kwon, C.H. , Do, J.A. , Im, M.H. , Lee, Y.D. , & Choung, M.G. 2010. Determination of formesafen residue in agricultural commodities using HPLC-UVD/MS , Korean Journal of Pesticide Science14(2): 100-108.
    8. Lee, S.J. , Kim, Y.H. , Song, L.S. , & Choung, M.G. 2011 a. Determination of ametryn residue in agricultural commodities using HPLC-UVD/MS , Korean Journal of Pesticide Science15(2): 125-133.
    9. Lee, S.J. , Kim, Y.H. , Song, L.S. , Hwang, Y.S. , Lim, J.D. , Sohn, E.H. , Im, M.H. , Do, J.A. , Oh, J.H. , Kwon, K.S. , Lee, J.K. , Lee, Y.D. , & Choung, M.G. 2011 b. Development of analytical method for fenoxycarb, pyriproxyfen and methoprene residues in agricultural commodities using HPLC-UVD/MS . Korean Journal of Pesticide Science15(3): 254-268.
    10. Lee, Y.D. 2017. Pesticide Analytical Residues Manual in Food Code. Ministry of Food and Drug Safety, Seoul, Korea.
    11. Lynch, S.M. , Rusiecki, J.A. , Blair, A. , Dosemeci, M. , Lubin, J. , Sandler, D. , Hoppin, J.A. , Lynch, C.F. , & Alavanja, M.C. 2006. Cancer incidence among pesticide applicators exposed to cyanazine in the agricultural health study . Environmental Health Perspectives114(8): 1248-1252.
    12. McLafferty, F.W. , & Turecek, F. 1993. Interpretation of mass spectra, pp. 19-50, 4th ed.Sausalito, CA, USA.
    13. Meador, M. , & Jie, M. 2014. Maximum residue limits for pesticides in food, p. 130, Beijing, China.
    14. NewZealand Food Safety Authority. 2007. Technical information sheets for purposed MRLs, p. 8.
    15. Ministry of Food and Drug Safety. 2017. Korea Food Code, pp. 10-4-340-10-4-342.
    16. Park, H.K. , Noh, H.H. , Lee, K.H. , Lee, J.Y. , Park, Y.S. , Kang, K.W. , Lee, E.Y. , Yun, S.S. , Jin, C.W. , & Kyung, K.S. 2011. Residual characteristic of chlorpyrifos in squash and estimation of its residues before harvest , Korean Journal of Pesticide Science15(4): 463-470.
    17. Sănchez-Rasero, F. , & Dios, G.C. 1988. Liquid chromatographic method for the determination of cyanazine in the presence of some normal soil constituents , Journal of Chromatography447: 426-431.
    18. US FDA. 1999. Pesticide Analytical Manual, Vol 1: Multi-residue Methods (3rd ed.), US Food and Drug Administration, USA.
    19. World Health Organization. 2003. Cyanazine in drinking-water, Background document for development of WHO guidelines for drinking-water quality, p. 1, 2nd ed. Geneva, Switzerland.
    20. Zhang, G. , & Pan, J. 2011. Simultaneous spectrophotometric determination of atrazine and cyanazine by chemometric methods , Spectrochimica Acta Part A.78, 238-242.