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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.30 No.2 pp.120-124
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2018.30.2.120

Establishment of Discrimination System Using Multivariate Analysis of FT-IR Spectroscopy Data from Different Species of Coffee (C. arabica)

Chun Hwan Kim, Young Bin Jung, Chan Kyu Lim, Seong Chel Kim, Seung Yeob Song†
Research Institute of Climate Change and Agriculture, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, 281 Ayeonno, Jeju 690-150, Republic of Korea
Corresponding author (Phone) +82-64-741-2565 (E-mail) s2y337@korea.kr
April 25, 2018 June 15, 2018 June 19, 2018

Abstract


FT-IR spectral analysis based on multivariate analysis can be used to discriminate between coffee (C. arabica) plants leaf. Whole cell extracts can be used to leaves eight coffee plants and the metabolic level was subjected to Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy. FT-IR spectral data from leaves were analyzed by PCA (principal component analysis), PLS-DA (partial least square discriminant analysis) and HCA (hierarchical clustering analysis). FT-IR spectrum confirmed differences between the frequency regions of 1,700-1,500, 1,500-1,300 and 1,100-950 cm-1, respectively. These spectral regions reflect the quantitative and qualitative variations of amide I, II from 1,700-1,500cm-1 (amino acids and proteins), phosphodiester groups from 1,500-1,300cm-1 (nucleic acid and phospholipid) and 1,100-950cm-1 (carbohydrate compounds). PCA revealed separate clusters that corresponded to similar species relationship. And PLS-DA showed similar species classification of coffee (C. arabica). Thus, PCA and PLS-DA could be used to the the distinction between coffee species with different metabolite contents. This study, these metabolic discrimination systems could be used for the rapid selection and classification of useful coffee cultivars.



FT-IR 스펙트럼 데이터로부터 다변량통계분석기법을 이용한 커피의 대사체 수준 품종 분류

김 천환, 정 영빈, 임 찬규, 김 성철, 송 승엽†
농촌진흥청 국립원예특작과학원 온난화대응농업연구소

초록


    Rural Development Administration
    PJ011936

    서 론

    세계적으로 커피는 가장 소비가 많이 되는 음료 중 하나 이다. 커피는 크게 Coffee arabica 와 Coffee canephora로 분 류되는데 이중 C. arabica는 전세계 70%를 차지한다(Vega, 2008). 우리나라의 커피 소비량은 경제 수준에 향상으로 인해 생활 속 여가와 문화생활이 높아짐에 따라 다양하고, 고급 커 피 소비가 빠르게 성장하고 있다. 또한, 커피의 형태도 다양하 게 소비되고 있다. 하지만, 국내에서 재배되는 커피의 양이 제 한적이며, 대부분 수입에 의존하고 있다.

    커피를 재배하기 위해서는 자연적 조건으로 위도, 해발고도, 토 양, 기후가 중요하다. 위도는 적도를 중심으로 남북위 25도 사이 에서 재배가 되고, 해발고도는 적도 지방에서는 1,000~ 2,100m 이며, 적도외 지역에서는 400~1,200m 지대에서 재배가 된다. 토 양은 배수가 잘되는 응회암, 화산재, 현무암과 화강암의 토양이 최소 2m가 있어야 가능하다. 기후 조건은 기온이 15~25°C, 강 수량은 연간 1,200~1,500mm와 월간 70mm가 적당하고, 습도는 60%가 적당하다. 이상의 조건들은 현재 아열대 기후로 변화 중 인 제주지역에 적합한 작물로 지형, 토양, 습도의 조건이 일치하 며, 한국형 커피 생산이 가능하다(Kim et al., 2011).

    Fourier transform infrared(FT-IR) spectroscopy을 이용한 대 사체학 연구가 진행되면서 시료간의 양적, 질적 차이를 대사체 수준에서 확인되고 있다. Fourier transform infrared(FT-IR) spectroscopy, proton nuclear magnetic resonance(HNMR) spectroscopy 및 mass spectrometry(MS) 등의 기기들은 대사 체 연구에 이용되고 있으며 각각의 장비에서 분석된 데이터를 이용하여 시료의 식별 및 대사체 마커 개발에 활용이 되고 있 다(Krishnan et al., 2005). FT-IR 스펙트럼은 스펙트럼상에 amino acids(glutamic acids 1700-1750cm-1, Aspartic 1400- 1430 cm-1, Trytophan 1360 cm-1) 그룹이나 proteins(α-Helix 1275 cm-1, Anti-parallel β-sheet 1235 cm-1), Lipids/fatty acids (υ(C-C) 1100-800 cm-1), monosaccharides(α, β-Glucose, β- Fructose 898-847 cm-1) 등 다양한 정보를 포함하고 있고 다변 량 통계분석(PCA, PLS-DA, HCA)을 이용하면 신속하고 정확 하게 품종 구분할 수 있다(Schulz and Baranska, 2007; Gallardo-Velázquez et al., 2009). FT-IR 분석 기술을 이용하 여 미생물종의 유연관계를 식별하고(Goodacre et al., 1998; Timmins et al., 1998; Wenning et al., 2002), 돌연변이 선 발(Chen et al., 1998; Stewart et al. 1997), 고등식물의 종 구분 (Kim et al., 2004), 두과작물 품종 식별(Song et al., 2012) 등에 활용이 가능하다고 보고된 바 있다.

    따라서 본 연구는 FT-IR 스펙트럼의 데이터를 이용하여 다 변량통계분석 기법을 통해 제주특별자치도에서 재배될 수 있 는 커피 품종을 대사체 수준에서 신속한 품종 식별 체계를 확 립하고, 우수한 계통 선발을 위한 품종 식별 기술을 구축하고 자 한다.

    재료 및 방법

    식물재료

    본 연구는 제주특별자치도 국립원예특작과학원 온난화대 응농업연구소 포장 내 무가온하우스에서 재배되고 있는 커 피(C. arabica) 8종의 품종을 사용하였다. 연구에 사용된 커 피는 Arabica 종인 ‘Catuai’, ‘Caturra’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Mahsellesa’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 7종과 교배종 1종을 사용하 였다. 8종 각각의 라인 잎을 3반복으로 시료를 준비하여 대사 체 분석에 이용하였다. 각각의 잎 시료는 동결건조하여 막자 와 막자사발을 이용하여 분말 형태로 분쇄하였다. 분쇄된 잎 시료는 -70°C 초저온냉동고에 보관하여 사용하였다.

    커피 whole-cell 추출물 제조

    8종의 커피 잎 시료 분말 20 mg을 1.5 mL Eppendorf tube 에 넣고 20%(v/v) methanol 200 μL을 첨가하여 시료와 용액 이 잘 섞이도록 vortexing하여, 50°C water bath에서 20분간 추출하였다. 추출된 시료는 15분간 13,000 rpm에서 원심분리 하고, 원심분리 후 상층액을 새로운 tube에 옮겼다. 추출물 찌 꺼기를 완전히 제거하기 위해 다시 한번 5분간 13,000 rpm에 서 원심분리하여 상층액을 새로운 tube로 옮겼다. FT-IR 스펙 트럼 분석에 사용하기 위해 추출된 추출물은 -20°C에서 냉동 보관하여 사용하였다(Song et al., 2014).

    FT-IR 스펙트럼과 데이터 전처리 및 다변량 통계분석

    FT-IR (Fourier transform infrared) 스펙트럼 조사는 Tensor 27 (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany)과 DTGS (Deuterated triglycine sulfate) 검출기를 사용하였다(Song et al., 2014). 추출된 각각의 시료는 5 μL씩 3반복으로 384-well ZnSe plate에 분주하여, 37°C hot plate에서 약 30분간 건조 한 후 HTS-XT (Bruker Optics GmbH) 고효율 자동화 장치 를 이용하여 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼은 4000-400 cm-1 범위에서 4 cm-1 간격으로 128회 반복 측정되었고, 측정된 스 펙트럼의 평균 스펙트럼을 분석에 사용하였다. Bruker 에서 제 공하는 OPUS Lab (ver. 6.5, Bruker Optics Inc.)를 사용하 여 FT-IR 스펙트럼 분석 영역의 양 끝점(800-1800 cm-1)의 흡 광도를 0으로 조정하고, 오차를 최소화하기 위하여 각 스펙트 럼을 동일 면적으로 normalization을 실시하였으며, baseline 교정을 실시하였다. 가공된 스펙트럼은 mean centering 과정을 거쳐 2차 미분하고 FT-IR 스펙트럼 조사 및 데이터 변환에 사용하였다.

    가공된 FT-IR 스펙트럼 데이터는 NIPALS 알고리즘(Wold, 1966)을 이용하여 R 프로그램(version 3.1.2)을 사용하여 PCA(Principal component analysis)와 PLS-DA(Partial least squares discriminant)분석을 수행하였다(Fiehn et al. 2000; Trygg et al. 2007). PCA 및 PLS-DA 분석을 통해 얻어진 score를 이용하여 HCA(hierarchical clustering analysis) 분석 하였으며 유사도 지수로 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean analysis)를 사용한 Euclidean distance를 측정하여 각 시료의 유연관계를 dendrogram으로 나 타냈다.

    결과 및 고찰

    커피의 FT-IR 스펙트럼 비교 분석

    커피 잎으로부터 전세포추출물의 FT-IR 스펙트럼 데이터는 다변량통계분석을 통해 커피 작물의 대사체 수준에서 유연관 계를 규명하고 품종 식별을 분석하였다. ‘Catuai’, ‘Caturra’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Mahsellesa’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 7종과 ‘non’ 교배종 1종 등 커피 작물들은 FT-IR 스펙트럼상에서 대 사체의 양적, 질적 패턴 변화가 나타났다(1700-1500, 1500- 1300, 1100-950cm-1)(Fig. 1). FT-IR 스펙트럼의 1700-1500, 1500-1300, 1100-950cm-1 주요 부위는 각각 특정 화합물들을 나타내는데, 주로 Amide I 과 II을 포함하는 아미노산 및 단 백질계열의 화합물들의 질적, 양적 정보를 나타내고(P = O, C = O, N-H, C-C 그리고 C = C), phosphodiester group을 포함한 핵산 및 인지질의 정보가 반영이 되고(CH2와 P = O), 단당류나 복합 다당류를 포함하는 carbohydrates 계열의 화합물들이 질적, 양적 정보가 반영(C-O, C-C 그리고 C-O-C) 되어 나타낸다(Parker, 1983; Dumas and Miller, 2003; Wolkers et al., 2004; Yee et al., 2004; D’Souza et al., 2008; Lopez-Sanchez et al., 2010). 이처럼 FT-IR 스펙트럼 상의 질적, 양적 차이가 커피 품종이 함유하고 있는 아미노산 이나 단백질, 지방산, 그리고 탄수화물계통의 화합물들의 질 적, 양적 차이가 현저하게 나타남을 의미한다. 따라서, FT-IR 스펙트럼 분석은 커피의 주요 대사체의 질적, 양적 변화를 분 석하여 계통 선발 수단으로 신속한 활용이 가능할 것이다.

    FT-IR 스펙트럼 다변량 통계분석 및 유연관계 분석

    8종 커피의 FT-IR 스펙트럼 데이터를 PCA 분석한 결과 PC 1과 2의 설명력이 64.2%와 11.8%로 각각 나타났다(Fig. 2A). 전체 커피 품종 중 ‘Caturra’와 ‘Mahsellesa’ 품종을 제 외한 ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그리고 ‘non’ 품종이 대사체 수준에서 유사성이 높게 나타났고, 각각 의 그룹을 형성하였다. ‘Caturra’와 ‘Mahsellesa’ 품종은 외각 의 그룹을 형성하면서 ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그리고 ‘non’ 품종들과는 차이를 나타냈다. ‘Caturra’와 ‘Mahsellesa’ 품종은 좌측과 상측의 그룹을 나타내 면서 C. arabica 종에서도 다른 대사체 정보를 나타내는 것으 로 판단되고, ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그리고 ‘non’ 품종은 유사한 대사체 정보를 나타내는 것으로 판단된다(Fig. 2A). 이처럼 동일한 C. arabica 계통에서도 대 사체 정보에 의해 품종간 분류가 가능한 것으로 나타났다. 대 사체 정보를 이용한 품종 분류에 대한 보고에 따르면, 아티초 크에서도 대사체를 이용한 품종 분류가 가능하였고(Kim et al., 2016), 다양한 종류의 아프리칸 얌 또한 품종간 분류가 가능하였다(Song et al., 2014). 또한, PCA 분석을 통해 대사 체 수준에서 두과작물 계통 분류가 가능하다고 보고되었다 (Song et al., 2012). 이 결과들은 커피 품종간에 대사체 수준 의 차이가 뚜렷하게 나타나는 것으로 보아 대사체 수준에서 마커 탐색에 가장 중요한 작용할 것으로 판단된다.

    8종 커피의 대사체 수준 식별에 중요하게 작용한 FT-IR 스 펙트럼 부위를 확인하였다(Fig. 2B). FT-IR loading value를 확인한 결과, PC 1과 2를 분류하는 중요한 기준은 1650- 1550, 1450-1350 그리고 1100-1000cm-1 부위임을 알 수 있었 다(Fig. 2B). 1650-1550, 1450-1350 그리고 1100-1000cm-1 부위는 FT-IR 스펙트럼상에서 차이를 나타냈던 부위(Fig. 1)와 일치하였고, 이 부위가 나타내는 amide I, II와 carbohydrates 계열의 화합물들이 양적, 질적 차이를 보이면서 커피 대사체 수준 식별에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알 수 있었다 (Schulz and Baranska, 2007)(Fig. 2B).

    PLS-DA 분석의 경우 PCA 분석 보다 커피의 종간 식별이 뚜렷하게 나타났다(Fig. 3A). PLS-DA score plot을 보면 ‘Caturra’와 ‘Mahsellesa’ 품종이 ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그리고 ‘non’ 품종과는 다르게 그룹을 형 성하였고, ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그 리고 ‘non’ 품종이 비슷한 위치에 그룹을 형성하면서 6개의 품종이 비슷한 대사체 정보를 나타내는 것으로 판단된다. 또 한, ‘non’ 품종은 교배종으로 ‘CR-95’와 ‘Geisra’ 품종과 근접 하면서 대사체 정보로 볼 때 두 품종의 교배종으로 판단된다 (Fig. 3A). 이 결과, FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 PLSDA 분석으로 커피의 품종 구분이 가능함을 알 수 있었다.

    HCA dendrogram 분석 결과를 이용하여 ‘non’ 품종의 교배 를 확인하였다(Fig. 3B). ‘non’ 품종은 ‘CR-95’와 ‘Geisra’ 품 종에 높은 유연관계를 나타냈고, ‘Catuai’ 품종과도 유연관계 를 나타냈다. 또한, ‘CR-95’, ‘Geisra’ 과 ‘Catuai’ 품종이 대 사체 분석을 이용한 유연관계 분석에서 유연관계가 다른 품종 에 비해 높게 나타나는 것으로 보아 대사체 정보가 유사한 것 으로 판단된다. 이상의 연구 결과로 판단할 때 커피의 FT-IR 스펙트럼 다변량통계분석을 이용한 대사체 수준에서 커피 품 종 구분이 가능함을 알 수 있었다. 대사체 분석을 이용한 커 피 품종 구분은 현재까지 다양하게 적용되고 있지 않지만 최 근 다양한 작물에서는 대사체 분석을 이용한 품종 식별 사례 가 보고되어 있다. 특히, 두과작물과 아티초크에서 품종간 대 사체 수준에서 FT-IR 스펙트럼의 특정 부위가 질적, 양적 차 이를 통해 품종을 구분이 가능하다고 보고되었다(Song et al., 2012, Kim et al., 2016). 이 FT-IR 스펙트럼의 부위들은 커 피에서 중요하게 작용한 FT-IR 스펙트럼과 일치하는 것을 볼 수 있었다. 또한, FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 PLS 분석 이 바위 솔 종간 유연관계가 개체간에 대사물질이 차이를 보 였고, 분류학적 유연관계가 92.9%로 높은 예측의 정확도를 나 타났다고 보고된 바 있다(Kim et al., 2011). 그리고 아프리칸 얌에서도 대사물질과 기능성성분을 PLS 분석을 통해 예측이 가능하다고 보고된 바 있다(Song et al., 2014).

    따라서 본 연구에서 확립된 대사체 수준에서 커피 품종 식 별 기술은 교배와 계통의 신속한 선발 수단으로 활용이 가능 할 것으로 예상된다.

    적 요

    본 연구에서는 커피(C. arabica)의 FT-IR 스펙트럼 데이터 를 기반한 다변량통계분석을 이용한 대사체 분석을 통해 품종 식별을 하여 육종 연구에 기초자료로 활용하고자 한다.

    1. FT-IR 스펙트럼 데이터를 이용한 PCA(principal component analysis), PLS-DA(partial least square discriminant analysis) 그리고 HCA(hierarchical clustering analysis) 분석을 통해 품종 분류가 가능하였다.

    2. 커피 품종들은 FT-IR 스펙트럼 부위인 1700-1500-1 (Amide I 과 II을 포함하는 아미노산 및 단백질계열의 화합물 들), 1500-1300-1 (phosphodiester group을 포함한 핵산 및 인 지질의 정보), 1100-950cm-1 (단당류나 복합 다당류를 포함하 는 carbohydrates 계열의 화합물)에서 질적, 양적 정보의 차이 가 나타났다.

    3. PCA 상에 나타난 8품종의 커피 품종이 각각 그룹을 형 성하였다. 그 중 ‘Caturra’와 ‘Mahsellesa’ 품종은 각각의 그룹 을 나타내면서 C. arabica 종에서도 다른 대사체 정보를 나타 내는 것으로 확인하였고, ‘Catuai’, ‘CR-95’, ‘Geisra’, ‘Obata’, ‘Vemecia’ 그리고 ‘non’ 품종은 유사한 대사체 정보 를 나타내는 것으로 확인하였다.

    4. PLS-DA 분석의 경우 PCA 분석 보다 커피 품종간 식별 이 뚜렷하게 나타났다.

    5. 본 연구에서 확립된 대사체 수준에서 커피의 품종 식별 기술은 품종, 계통의 신속한 선발 수단으로 활용이 가능할 것 으로 기대되며 육종을 통한 품종개발 가속화에 기여 할 수 있 을 것으로 예상된다.

    ACKNOWLEDGMENTS

    본 논문은 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 열대작물(커피, 카카오) 유전자원 조사 및 특성평가, 세부과제번호: PJ011936) 의 지원으로 수행된 결과입니다.

    Figure

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    Representative FT-IR spectral from C. arabica leaves of the main cultivar. FT-IR spectral ranges showed quantitative information of protein/amide I, II (1500-1700 cm-1), phosphodiester group (1300-1500 cm-1), and sugar compound (950-1100 cm-1). *n = 3

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    PCA score plot (A) and loading value plot (B) of PCA analysis from FT-IR data of C. arabica leaf. Dotted shapes represent significant FT-IR spectral region for metabolic discrimination of each C. arabica.

    KSIA-30-120_F3.gif

    PLS-DA score plot (A) and Hierarchical dendrogram (B) of FT-IR data from C. arabica leaf. Dotted shapes represent significant FT-IR spectral region for metabolic discrimination of each C. arabica.

    Table

    Reference

    1. L. Chen , N.C. Carpita , W.D. Reiter , R.H. Wilson , C. Jeffries , M.C. McCann (1998) A rapid method to screen for cell-wall mutants using discriminant analysis of Fourier transform infrared spectra., Plant J., Vol.16 ; pp.385-392
    2. L. D'Souza , P. Devi , M.P.D. Shridhar , C.G. Naik (2008) Use of Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy to Study Cadmium- Induced Changes in Padina Tetrastromatica (Hauck)., Anal. Chem. Insights, Vol.3 ; pp.135-143
    3. P. Dumas , L. Miller (2003) The use of synchrotron infrared microspectroscopy in biological and biomedical investigations., Vib. Spectrosc., Vol.32 ; pp.3-21
    4. O. Fiehn , J. Kopka , P. Drmann , T. Altmann , R. Trethewey , L. Willmitzer (2000) Metabolite profiling for plant functional genomics., Nat. Biotechnol., Vol.18 ; pp.1157-1161
    5. T Gallardo-VelA zquez , G Osorio-Revilla , M. Z Loa (2009) Application of FTIR-HATR spectroscopy and multivariate analysis to the quantification of adulterants in Mexican honeys., Food Res. Int., Vol.42 ; pp.313-318
    6. R. Goodacre , E.M. Timmins , R. Burton , N. Kaderbhai , D.B. Kell , P.J. Rooney (1998) Rapid identification of urinary tract infection bacteria using hyperspectral whole-organism fingerprinting and artificial neural networks., Microbiology, Vol.144 ; pp.1157-1170
    7. C.H. Kim , K.C. Seong , Y.B. Jung , C.K. Lim , D.G. Moon , S.Y. Song (2016) Establishment of discrimination system using multivariate analysis of FT-IR spectroscopy data from different species of artichoke (Cynara cardunculus var. scolymus L.)., Kor J Hortic Sci Technol, Vol.34 (2) ; pp.328-334
    8. H.K. Kim , B.K. Yoon , Y.M. Park (2011) An Exploratory Study on Korea Green coffee bean Cultivation for the future., Association of Korean Photo-Geographers., Vol.21 (3) ; pp.139-152
    9. S.W. Kim , S.H. Ban , H. Chung , S.H. Cho , H.J. Chung , P.S. Choi , O.J. Yoo , J.R. Liu (2004) Taxonomic discrimination of higher plants by multivariate analysis of Fourier transform infrared spectroscopy data., Plant Cell Rep., Vol.23 ; pp.246-250
    10. S.W. Kim , Y.K. Kwon , J.M. Seo , T.H. Woo , J.R. Liu (2011) Prediction and discrimination of taxonomic relationship within Orostachys species using FT-IR spectroscopy combined by multivariate analysis., J. Plant Biotechnol., Vol.38 ; pp.9-14
    11. P. Krishnan , N.J. Kruger , R.G. Ratcliffe (2005) Metabolite fingerprinting and profiling in plants using NMR., J. Exp. Bot., Vol.56 ; pp.255-265
    12. M. Lopez-Sanchez , M.J. Ayora-Canada , A. Molina-Diaz (2010) Olive Fruit Growth and Ripening as Seen by Vibrational Spectroscopy., J. Agric. Food Chem., Vol.58 ; pp.82-87
    13. F.S. Parker (1983) Applications of infrared, Raman and resonance Raman spectroscopy in biochemistry. Plenum Press, New York. Schulz H, and Baranska M. 2007. Identification and quantification of valuable plant substances by IR and Raman spectroscopy., Vib. Spectrosc., Vol.43 ; pp.13-25
    14. S.Y. Song , T.J. Ha , K.C. Jang , I.J. Kim , S.W. Kim (2012) Establishment of rapid discrimination system of leguminous plants at metabolic level using FT-IR spectroscopy with multivariate analysis., J. Plant Biotechnol., Vol.39 ; pp.121-126
    15. S.Y. Song , E.Y. Jie , M.S. Ahn , D.J. Kim , I.J. Kim , S.W. Kim (2014) Discrimination of African Yams Containing High Functional Compounds Using FT-IR Fingerprinting Combined by Multivariate Analysis and Quantitative Prediction of Functional Compounds by PLS Regression Modeling., Weonye Gwahag Gisulji, Vol.32 ; pp.105-114
    16. D. Stewart , N. Yahiaoui , G.J. McDougall , K. Myton , C. Marque , A.M. Boudet , J. Haigh (1997) Fourier-transform infrared and Raman spectroscopic evidence for the incorporation of cinnamaldehydes into the lignin of transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) plants with reduced expression of cinnamyl alcohol dehydrogenase., Planta, Vol.201 ; pp.311-318
    17. A%. M Timmins (1998) Rapid differentiation of closely related Candida species and strains by pyrolysis-mass spectrometry and Fourier transform-infrared spectroscopy., J. Clin. Microbiol., Vol.36 ; pp.367-374
    18. J. Trygg , E. Holmes , T. Londstedt (2007) Chemometrics in metabonomics., J. Proteome Res., Vol.6 ; pp.467-479
    19. F.E. Vega (2008) The Rise of Coffee: From humble origins in Africa, this plant ?(tm)s flavorful seeds started as a botanical curiosity and expanded to a worldwide staple., Am. Sci., Vol.96 (2) ; pp.138-145
    20. M. Wenning , H. Seiler , S. Scherer (2002) Fourier-transform infrared microspectroscopy, a novel and rapid tool for identification of yeasts., Appl. Environ. Microbiol., Vol.68 ; pp.4717-4721
    21. H. Wold , K.R. Krishnaiah (1966) Multivariate Analysis., Academic Press, ; pp.391-420
    22. W.F. Wolkers , A.E. Oliver , F. Tablin , J.H. Crowe (2004) A fourier transform infrared spectroscopy study of sugar glasses., Carbohydr. Res., Vol.339 ; pp.1077-1085
    23. N. Yee , L.G. Benning , V.R. Phoenix , F.G. Ferris (2004) Characterization of metal-Cyanobacteria sorption reactions: A combined Macroscopic and infrared spectroscopic investigation., Environ. Sci. Technol., Vol.38 ; pp.775-782