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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.29 No.2 pp.180-184
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2017.29.2.180

Evaluation of Radish (Raphanus raphanistrum subsp. sativus L.) Inbred Lines Resistant to Cucumber mosaic virus

Ju-Yeon Yoon, Gug-Seoun Choi, Su Kim*, Seung-Kook Choi
*
Department of Horticultural and Herbal Environment, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Wanju, 55365, Korea
*Department of Vegetables, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Wanju, 55365, Korea
Corresponding author : +82-63-238-6322viroid73@gmail.com
October 18, 2016 May 1, 2017 June 20, 2017

Abstract

In order to evaluate CMV resistance of the radish inbred lines, leaves of twenties radish (Raphanus sativus L.) inbred lines were mechanically inoculated with a strain of Cucumber mosaic virus (CMV) systematically infecting radish plants, respectively. The inoculated radish plants were incubated at 22°C±3°C and resistance assessment was examined using symptom development for 4 weeks. Based on the reactions of differential radish inbred lines, 11 radish lines were produced mosaic, mottling, yellowing and severe mosaic symptoms by CMV infection. These results were confirmed by RT-PCR analysis of CMV coat protein gene, suggesting that CMV is responsible for the disease symptoms. In contrast, 9 resistant radish lines did not induce systemic mosaic symptoms on upper leaves and chlorosis in stem tissues for 4 weeks, showing that the radish plants did not express any symptoms by 8 weeks. Further examination of CMV infection in the 9 resistance-candidate radish lines showed no CMV infection in systemic leaves of the 9 radish lines. Taken together, these results suggest that the 9 radish lines are highly resistant to CMV.


오이모자이크바이러스에 대한 무 육종 계통 저항성 평가

윤 주연, 최 국선, 김 수*, 최 승국
*
국립원예특작과학원 원예특작환경과
*국립원예특작과학원 채소과

초록


    Rural Development Administration
    PJ012643

    배추과(Brassicaceae family)에 속하는 무(Raphanus sativus) 는 아시아 및 지중해 연안이 원산지로 알려진 한해살이 또는 두해살이 식물이다. 우리나라의 5대 채소 가운데 하나이며, 우 리나라 전체 채소 생산량 대비 무는 10−15%로, 배추와 더불 어 우리의 주요 부식인 김치, 단무지, 외식업체의 식재료로 사 용되는 중요 작물 중 하나이다 (Ku et al., 2006; Lee et al., 2009). 영양가치 측면에서 무는 필수무기질들과 칼슘, 비타민 등이 풍부하여, 특히 한국인들에게 중요 무기영양을 공급하는 겨울철에 말린 무청을 활용한 다양한 식단이다. 한편, 최근 많 은 양의 화학비료를 사용하는 무의 연작재배지에서 각종 생리 적 장해와 바이러스 병이 점차 증가하고 있다. 특히 무 및 배 추 등에서 순무모자이크바이러스 (Turnip mosaic virus, TuMV)와 Bromoviridae과(科, family) Cucumovirus속(屬, genus)에 분류되는 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus, CMV)를 비롯한 5종 바이러스들이 보고되었다 (Choi & Choi, 1992; Chung et al., 2015; Ham, 1995; Kim et al., 2012). 오이모자이크바이러스 및 순무모자이크바이러스에 의한 피해가 우리나라뿐만 아니라 세계적으로도 무 재배 지역에서 흔하게 일어나고 있어 병의 피해가 가장 크며 지속적으로 발 생하고 있다 (Palukaitis & Garcia-Árenal, 2003). 여러 보고들 을 종합한 연구에 의하면, 오이모자이크바이러스는 배추과에 속한 주요 작물 및 잡초를 포함하여 90과 1000여종 이상의 식 물들을 감염시킬 수 있으며, 자연계에서는 약 90여종의 진딧물 을 통한 비영속적 전반 (non-persistent transmission)으로 식물 과 식물 사이 퍼져나가는 것으로 알려져 있다 (Palukaitis & Garcia-Árenal, 2003). 우리나라에서는 고추, 토마토 등 가지과 작물들 및 화훼류 작물들에서 가장 큰 피해를 끼치는 바이러스 중 하나로 알려져 있다 (Han et al., 2012; Kim et al., 2012).

    오이모자이크바이러스는 병리학적으로 3개 그룹으로 크게 분류되는데, 첫 번째로 서브그룹 IA에 속하며, 병원성은 강한 계통들이 속한다. 대부분 진딧물에 의한 비영속적 전염을 쉽 게 하며, 때로는 위성RNA (satellite RNA)를 가지고 있는 경 우도 있다. 두 번째로는 주로 아시아 대륙에서 발견되는 서브 그룹 IB 계통들인데, 오이모자이크바이러스 서브그룹 IA에 대 한 작물 저항성을 무너뜨리는 계통으로 알려져 있다. 병원형 은 서브그룹 IA와 유사하지만, 많은 경우 잡초나 서양에 존재 하지 않는 아시아 유래된 재래 식물들에서 분리되는 경우가 많다. 마지막으로 서브그룹 II 에 속하는 오이모자이크바이러 스 계통들이 존재하는데, 대부분 이 그룹에 속하는 오이모자 이크바이러스는 병원형이 서브그룹 IA 및 IB 계통들과 다르 게 약한 특징이 있으며, 외피단백질 유사성은 70~78% 정도로 상동성을 가지고 있다. 그러나 위성RNA를 매우 잘 복제하는 특징이 있다 (Palukaitis & Garcia-Árenal, 2003). 오이모자이 크바이러스 계통들 모두가 배추 및 무 등을 감염시킬 수 있는 것이 아니며, 계통들에 따라 배추 및 무를 감염시킬 수 있는 병리학적 특성이 다른 것으로 알려져 있다 (Takeshita & Takanami, 2000).

    오이모자이크바이러스병을 예방하기 위한 가장 효율적인 방 법 중 하나인 오이모자이크바이러스에 대한 새로운 저항성 유 전자원 선발 및 저항성 품종의 육종이 필요하며, 이를 위해서 는 오이모자이크바이러스에 강한 저항성을 가지는 무 계통들 에 대한 저항성 조사를 수행한 결과이다.

    재료 및 방법

    바이러스 접종원 및 식물 재배

    2014년 1월 제주도의 무에서 분리하여 보존하고 있는 오이 모자이크바이러스 RAD1 계통 (CMV-RAD1)을 시험 바이러 스로 사용하였다. 오이모자이크바이러스 RAD1 계통을 Nicotiana tabacum에서 10mM 인산완충액 (pH 7.0)을 이용하 여 즙액 접종법으로 증식시켰다. 바이러스가 감염된 모자이크 등 병징이 발현된 잎을 이용하여 10 mM 인산완충액 (pH7.0) 을 3대1 비율 (1 g 감염 잎 당 3 mL 인산완충액)로 첨가 후 막자사발에서 갈아서 바이러스 접종원을 준비하였다. 20개 무 육종 계통들은 국립원예특작과학원에서 보유하고 있는 원교- 11~원교-30까지 계통을 이용하였다. 무 육종 계통의 종자를 상 토 (바로커, 서울바이오)에 파종 후 본 잎이 4장이 나온 잎들 을 대상으로 각 계통 당 6개 개체를 선택하여 메쉬 600크기 연마제 (Carborundum®, Thermo Scientific, USA)를 뿌린 후, 오이모자이크바이러스 RAD1 계통이 감염된 즙액을 멸균된 면 봉에 묻힌 후 잎에 접종하였다. 대조구로서 건전한 N. tabacum 잎을 10 mM 인산완충액 (pH7.0)에서 위에서 기술한 방법과 동일하게 즙액 추출 후 연마제가 뿌려진 각 계통당 본 잎 4장이 나온 3개 무 식물들에 접종하였다. 바이러스 저항성 평가는 독립적으로 3회 반복 실시하였다.

    무 저항성 평가 및 바이러스 검출

    접종된 무 개체들은 전신 감염 병징을 관찰하기 위하여 22°C±3°C, 주간 16시간 야간 8시간으로 조절되는 식물 생장 상에서 28일동안 재배하였다. 접종하지 않은 무 상위엽을 대 조구로서 이용하여, 오이모자이크바이러스 RAD1이 접종된 무 개체들에서의 상위 잎에서의 병징을 육안으로 조사하였다. 무 상엽에서 오이모자이크바이러스 존재 유무를 정확하게 확인하 기 위하여, 무 상엽 일부분을 식물RNA추출키트 (Qiagen, Germany)를 이용하여, 제조회사에서 제공된 방법을 이용하 여 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 CMV-CP-Detect- For (5’-atggacaaatctgaatcaaccagtgct-3’), CMV-CP-Detect-Rev (5’-tcagactgggagcactccagatgtggg-3’)라 명명된 프라이머들을 이 용하여 One-Step SuperScriptIII® 역전사중합효소키트 (Thermo Scientific®, USA)를 이용하여 65°C, 10분 (1회), 얼음에 5분 간 방치 후, PCR 기계를 이용하여 55°C, 30분 및 95°C, 2분 (각 1회), 94°C, 30초, 55°C, 30초, 72°C, 60초 (35회 반복), 72°C, 10분 (1회) 증폭 반응을 시켰다. 반응 후 1.2% 아가로 스겔 전기영동으로 산물을 확인하였다 (Han et al., 2012).

    결 과

    무 육종 계통들의 저항성 평가

    2014년 1월 제주도의 무에서 분리하여 보존하고 있는 오이 모자이크바이러스 RAD1 계통 (CMV-RAD1)을 시험 바이러 스로 사용하여 지표 기주식물들의 생물학적 반응을 기초로 한 기주범위 조사 결과, 담배, 고추, 배추 및 무 등에서 모자이크 및 위축 등 전신감염을 시킬 수 있는 계통으로 조사되었다 (Table 1). 기주 식물들의 반응 및 병원성 특성으로 판단할 때 CMV-RAD1은 ,내에 우점하고 있는 CMV 계통의 기주 범위 를 갖고 있으면서 동시에 배추과 작물들을 감염시킬 수 있는 특성이 있었다.

    무 계통들에 대한 오이모자이크바이러스 저항성 계통들을 선발하기 위하여 CMV-RAD1을 이용하여 20개 무 계통들에 대한 저항성 평가를 수행하였다. 오이모자이크바이러스 RAD1 에 대한 무 계통들의 저항성 판정을 위한 지표로서 1) 오이모 자이크바이러스의 전신 감염 병징이 관찰되지 않은 무 계통을 1차 선발, 2) 무병징을 보이는 무 계통들의 상위잎에서 역전사 중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 이용하여 오이모자이크바이러 스의 유전자가 검출되지 않는 계통 선발을 선정하였다. 역전 사중합효소연쇄반응법을 위하여 오이모자이크바이러스의 외피 단백질 유전자가 포함되는 유전자 부위를 검출할 수 있는 프 라이머들을 이용하여 조사하였다 (Han et al., 2012). 오이모 자이크바이러스 RAD1 계통을 접종 28일 후 무 전신 감염 병징을 조사한 결과, 11개 무 육종 계통들 (Rad-V1 ~ Rad- V4, Rad-V9, Rad-V12 ~ Rad-V17) 에서 오이모자이크바이러 스에 대한 약한 모자이크, 심한 모자이크, 모틀링 및 황화 병 징을 나타내었으며, 감염된 식물체는 생육이 불량해지고 위축 이 되는 병징들이 관찰되었다 (Table 2). 예상한대로 11개 무 육종 계통 개체들에서 오이모자이크바이러스 외피단백질 유전 자를 포함하는 유전자 증폭 산물들이 검출되어, 오이모자이크 바이러스에 대해 감수성 계통으로 판명되었다 (Table 2).

    한편, 9개 무 육성 계통들에서는 앞서 관찰된 감수성 무 계 통들에서 관찰된 오이모자이크바이러스 의심 병징들이 접종 28일 후에도 접종되지 않은 상위잎에서 관찰되지 않았다 (Fig. 1 및 Table 2). 이런 9계통 무병징 무 계통들은 완충액만이 접종된 건전 대조구와 비슷한 정도로 생육되었다. 이런 9계통 들의 상위잎에서 오이모자이크바이러스가 잠복되어 존재하는 지 알아보기 위하여 실시한 역전사중합효소연쇄반응법으로 모 든 계통들에서 오이모자이크바이러스 외피단백질 유전자 증폭 산물들이 검출되지 않았다. 위의 결과들을 종합적으로 판단해 보면, 9개 무 육종 계통들이 오이모자이크바이러스에 대한 감 염을 억제하는 저항성을 가지고 있는 것을 의미하며 추후 다 양한 오이모자이크바이러스 F1 무 종자를 생산할 수 있는 육 종 소재로서 사용이 가능할 것으로 판단된다.

    고 찰

    오이모자이크바이러스 무 분리 계통은 보통 아시아 계통 무 품종들에서 약한 병징을 나타내거나 또는 병징이 없는 특성이 있다고 보고되었다. 국내 무 재배 포장에서 병징이 나타나지 않은 무 개체들에서 RT-PCR 방법으로 조사한 결과, 오이모자 이크바이러스가 단독 감염이 확인이 되었으나 대부분의 경우 순무모자이크바이러스 (Turnip mosaic virus, TuMV)와 중복 감염되었다 (Lee et al., 2011; Chung et al., 2015). 국내외 무 재배 포장에서는 오이모자이크바이러스와 순무모자이크바 이러스는 진딧물에 의해서 비영속적 전염으로 퍼져나간다. 순 무모자이크바이러스는 2종의 진딧물 (Myzus persicaeAphis gossypii)에 의해서 진딧물 전염이 잘 이루어지며, 오이 모자이크바이러스는 비록 2종의 진딧물이 비영속적 전염이 이 루어지나 M. persicae 보다는 A. gossypii 종에 의해 효과적 으로 퍼져나가는 것으로 알려져 있다 (Fujisawa, 1985). 몇몇 보고들에 의하면, 순무모자이크바이러스와 오이모자이크바이 러스가 중복 감염된 무에서 오이모자이크바이러스가 접종된 잎과 상엽에서 2배에서 36배까지 세포 내 농도가 증가되는 것 으로 알려져 있으며 (Sano & Kojima, 1989), 전자현미경을 이용한 세포내 입자 관찰에서 오이모자이크바이러스는 세포질 뿐만 아니라 액포막 근처에서도 많은 입자들이 관찰되었으 나, 오직 순무모자이크바이러스는 연한 모자이크 조직에서만 관찰되었다. 중복 감염된 무에서는 오이모자이크바이러스의 세 포와 세포사이 이동성은 증가하지는 않았으나, 순무모자이크 바이러스에 의해서 무 식물체로의 전신 이동성이 빨라져서 오 이모자이크바이러스 농도가 증가된 것으로 보고되었다 (Ishimoto et al., 1990). 또한 무 계통을 단독으로는 전신 감 염을 시킬 수 없는 오이모자이크바이러스 계통이 순무모자이 크바이러와 중복 감염이 되면, 이런 오이모자이크바이러스가 무에서 전신 감염을 시킬 수 있음이 보고되었으며, 인위적 접 종 농도실험에서 0.01mg/mL 순무모자이크바이러스 농도가 전 신 감염을 못하는 오이모자이크바이러스의 전신 이동 및 감염 을 촉진시킬 수 있었다 (Takeshita & Takanami, 2000). 후속 연구에 의하면 이런 상승효과 (synergism)는 오이모자이크바이 러스가 암호화하고 있는 유전자중 2b 유전자에 의해서 일부 관여하는 것으로 밝혀졌으나, RNA 침묵현상 (RNA silencing) 을 억제할 수 있는 2b 유전자 산물에 의한 역할보다는, 이미 무 세포내에 확립된 아직 구명되지 못한 저항성 기작을 바이 러스들 간의 상호작용으로 극복할 수 있는 것으로 예상되었다 (Takeshita et al., 2012). 오이모자이크바이러스에 대한 무의 피해를 줄이는 효과적인 방법은 무 포장에서 철저한 진딧물의 구제 및 저항성 무 품종 재배를 병행하는 것이다. 이번 연구 에서 선발된 오이모자이크바이러스에 대한 저항성 무 계통들 을 이용하여 품종 개발에 이용되어 추후 농가 피해를 줄일 수 있을 것으로 사료된다.

    적 요

    • 1. 무 (Raphanus sativus L.) 육종 계통들에 대한 오이모자 이크바이러스 (Cucumber mosaic virus, CMV) 저항성을 평가 하기 위하여, 20개 무 육종계통들의 잎에 오이모자이크바이러 스의 국내 분리 계통을 즙액 접종하였다.

    • 2. 오이모자이크바이러스를 접종한 무 개체들은 22°C±3°C에 서 재배하였으며 4주 동안 바이러스 병징 발현을 육안으로 조 사하여 저항성을 평가하였다.

    • 3. 11개 무 계통은 약한 모자이크, 모틀링에서 심한 모자이 크 등의 전신 감염 병징을 보였으며 오이모자이크바이러스 감 염이 역전사중합효소반응으로 확인되었다.

    • 4. 바이러스 병징을 보인 11개 무 계통은 오이모자이크바이 러스에 대한 감수성 계통들로 판정되었다.

    • 5. 9개 무 육종계통들에서는 감수성 개체들에서 관찰된 모 자이크 등 전신 감염 병징이 발현되지 않았으며 8주 동안 병 징이 관찰되지 않았다.

    • 6. 역전사중합효소연쇄반응으로 조사한 결과 9개 무 육종 계 통들의 상위 잎들에서 오이모자이크바이러스가 검출되지 않았 으므로 9개 무 육종계통들이 오이모자이크바이러스에 대한 저 항성 계통들로 판정되었다.

    ACKNOWLEDGMENT

    본 연구는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 “무의 내재해성 유전자원 수집 및 계통 집단 구축 (PJ012643)” 과제 지원을 받아 수행되었음

    Figure

    KSIA-29-180_F1.gif

    Symptoms of radish inbred lines infected with Cucumber mosaic virus (CMV) strain RAD1, 28 days post-inoculation. (A) Radish ‘Rad-V4’ line inoculated with 10mM phosphate buffer (pH7.0, Mock-inoculation) (B) Radish ‘Rad-V4’ line (susceptible to CMV) inoculated with CMV strain RAD1 as a control, showing mosaic symptoms in the upper leaves. (C) Radish ‘Rad-V7’ line (resistant to CMV) inoculated with CMV strain RAD1 showed no symptoms in the upper leaves.

    Table

    Symptoms of plant species inoculated with CMV-RAD1

    aSymptoms are briefly shown as symbols. ch, chlorosis; NLL, necrotic local lesion; mM, mild mosaic; M, mosaic; SM, severe mosaic; St, stunting; -, no infection confirmed using RT-PCR analysis.
    bInoculated leaves
    cUpper leaves

    Resistance of radish inbred lines against Cucumber mosaic virus strain RAD1

    aS : Susceptible, R : Resistant
    bmM : mild mosaic, M : mosaic, Mo&Y: mottling & Yellowing, SM : severe mosaic, ― : no symptom
    cnumber of plants developed systemic symptoms/ number of plants inoculated with CMV.
    dX : no detection of RT-PCR product for CMV, O : detection of RT-PCR product for CMV.

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