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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.27 No.4 pp.481-488
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2015.27.4.481

Changes in Isoflavone Content and Quality Characteristics of Cheonggukjang Prepared by Some Different Strains

Kyung Ha Lee
Hye Sun Choi
Kyung A Hwang
Jin Song†
Corresponding author (Phone) +82-10-8746-8043 (songjin@rda.go.kr)
July 30, 2015 October 28, 2015 October 30, 2015

Abstract

This study was conducted to investigate change of isoflavone composition (glycoside and bio-active aglycone) and to evaluate quality characteristics of Cheonggukjang which was prepared by different Bacillus strains (Bacillus subtilis HJ0-2, HJ18-9 and HJ25-8). The bioactivity of Cheonggukjang was enhanced by fermentation with different Bacillus strains for 48 hr at 37°C. The a-amylase and protease activities of Chungkookjang in HJ 0-2 higher than the other samples. Cellulase activity of Chungkookjang in HJ 18-9 higher than the other samples. The total aerobic and anaerobic cell counts of Chungkookjang in control were higher than the other samples. After 48 h fermentation, the contents of daidzein, genistein and glycitein in Bacillus subtilis HJ 25-8 were significantly increased up to 100.57 ± 4.59, 4.50 ± 2.67, 105.73 ± 5.87 μg/g respectively. And contents of daidzein, genistein and glycitein in control (not inoculation) were 61.23 ± 9.07, 8.43 ± 0.12, 71.93 ± 3.30 μg/g respectively. Amino type nitrogen contents and ammonia type nitrogen contents of Chungkookjang in HJ 0-2 higher than the other samples. These results suggest that could be used to increase the bioactivity via fermentation with Bacillus subtilis possesses β-glucosidase activity, with a view towards the development of functional foods.


균 종류에 따른 대원콩 청국장의 isoflavone 함량 및 품질특성

이 경하
최 혜선
황 경아
송 진†

초록


    Rural Development Administration
    PJ008533

    우리나라는 예로부터 콩 자체뿐 아니라 두부, 두유 형태로 이용하거나 발효시켜 간장, 된장 등 다양한 방법으로 콩을 식 생활에 사용해 왔다. 특히 콩은 종류에 상관없이 리신 등 필수 아미노산이 균형있게 배합되어있는 양질의 단백질 공급원이다 (Ko and Chun, 1986). 콩의 기능성 물질로는 isoflavones, phytic acid, trypsin inhibitor, saponins, 식물성 sterol 과 phenol 화합물 등과 식이성 섬유, 올리고당이 보고 되고 있으며 (Anderson and Wolf, 1995) aponin, phytic acid, isoflavones, hemaglutinins 등의 다양한 생리활성물질을 포함하고 혈중 콜 레스테롤을 낮추고 심혈관 질환, 골다공증 예방 등의 성인병 예방에 대한 가능성이 보고되고 있다(Lee and Kim, 2010). 콩 의 대표적인 생리활성 물질중의 하나인 isoflavone류는 lignan 류와 함께 식물에서 발견되는 phytoestrogen으로 본래 estrogen 과 같은 생리활성을 갖거나 장내균총에 의하여 생리활성화 되 는 phytochemical로 암세포의 증식에 관여하는 효소인 protein tyrosin kinase와 DNA topoisomerase Ⅱ의 작용을 저해하는 것으로 밝혀져 유방암 또는 전립선암 억제 등 발암억제 가능 성이 여러 측면에서 보고되어 있다(Dixon and Ferreira, 2002).

    대두 발효식품 중 청국장은 고초균을 통해 발효되고 독특한 풍미를 갖는 전통 콩 발효식품으로 간장과 된장에 비해 단시 간에 발효섭취가 가능하고, 독특한 맛과 풍미를 나타내며 여러 가지 필수아미노산과 식물성 지방 및 유기산들을 많이 함유하 여 영양 면에서도 우수한 식품으로 알려져 있다(Son and Lee, 2011; R.D.A. Food composition table, 1996).

    청국장 발효는 Bacillus subtilis, Bacillus licheniformisBacillus megaterium과 같은 Bacillus 속의 균주를 단독(Lee et al., 1991; Choi et al., 1998; Choi et al., 1998; Seok et al., 1994; Kim et al., 1997) 또는 두 균주를 혼합(Youn at al., 2002)하여 사용한 예가 보고되었다. 발효과정 중 청국장균이 생성하는 여러 가지 효소들에 의해 콩 껍질이나 세포막을 구 성하고 있는 섬유소 및 세포 내에 있는 당질이나 단백질이 분 해되면서 소화율이 향상되며 유리 아미노산이 월등이 많아지 게 된다(Kim and Hamn, 2003). 청국장의 냄새는 butyric acid, valeric acid, tetramethyl pyrazine과 같은 휘발성 물질 과 단백질이 아미노산으로 분해될 때 생성되는 암모니아 성분 에 기인하는 것으로 알려져 있다(Chang et al., 2011). 그 밖 에 청국장의 일반 품질에 관한 연구 보고로는 청국장의 이화 학적 특성 및 일반 성분변화(Park et al., 2001), 청국장의 고 분자성 점질물(Kim et al., 1982; Kim et al., 1996) 및 이화 학적 특성(Lee et al., 1991), 청국장의 물성변환(Krieg and Holt, 1984), 점질물의 이화학적 특성(Lee et al., 1991), 당류 와 유리아미노산의 변화(Lee et al., 1991), 유지성분(Lee and Suh, 1981), 향기성분(Lee et al., 1998; Park. 1972)등에 관 한 연구들이 보고된 바 있으며, 청국장의 발효율을 높이고 새 로운 기능성을 강화하기 위하여 여러 가지의 고초균과 Bacillus 속 균주 스타트를 증자 대두에 첨가하여 청국장 제조 및 그 품질특성에 관한 연구들이 있다. 그러나 아직 청국장 발효에 따른 isoflavone aglycone 함량 증가에 관련된 연구는 미비한 실정이다.

    따라서 본 연구에서는 체내이용률이 높은 isoflavone aglycone을 많이 생성할 수 있는 β-glucoside 활성을 지니는 우수한 Bacillus 속 균주들을 이용하여 청국장을 제조하여 그 에 따른 품질특성과 isoflavone 함량 변화를 조사하였다.

    재료 및 방법

    재료

    본 실험에서 사용된 대원콩(Glycine max)은 2013년산을 농 가에서 구입하여 사용하였다. 스타터로 사용된 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8은 선행연구(Lee et al., 2011)를 통해 장으로부터 분리된 균으로 cellulase 등의 세포의 효소분비능이 우수하며 항균활성이 우수한 균으로 본 실험에 서 스타터로 사용하였다.

    제조

    장류 콩인 대원콩은 세척 후 실온에서 침지(25°C, 24 hr)하 고 멸균기를 이용하여 증자(121°C, 30 min)하였다. 콩이 40°C 이하로 냉각되었을 때 각 분리균주의 배양액을 접종하여 37°C 에서 48 hr 발효하였다. 실험은 배양액을 첨가하지 않은 대조 구과 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8를 첨가한 처 리구로 나누어 진행하였다. 각 균주를 106CFU/mL 이상의 농 도가 되도록 배양하여 시료량의 1% (w/w)가 되도록 첨가 하였다.

    추출물 제조

    청국장 시료 20 g에 80 mL의 증류수(pH 7.0)를 첨가하고 균질화한 후 이를 원심분리(8,000 rpm, 10 min, 4°C)한 후 상 등액을 분석 시료로 사용하였다.

    α-Amylase 활성 측정

    α-Amylase 활성 측정은 D.U.N(Dextrinogenic Unit of Nagase)법(Yoon. 1998)에 의하여 측정하였다. 1% 전분 기질 액(0.2M sodium phosphate buffer, pH 7.0) 3 mL에 시료추 출액 1mL를 넣고 반응(40°C, 10min) 시킨 후 반응액 1mL에 0.1M HCl 10 mL를 넣어 반응을 정지시켰다. 반응을 정지시 킨 용액 1 mL에 0.005% I2-0.05% KI 용액 10 mL를 넣어 발색시킨 후 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 위와 같은 방 법으로 측정하여 다음 식에 의해 효소활성을 계산하였다.

    D.U.N=[(D-D')/D]×10/100×n

    D : Absorbance of control

    D': Absorbance of sample

    n : Dilution ratio of sample

    Protease 활성 측정

    Protease 활성 측정은 식품공전(KFDA. 2005)에 따라 측정 하였다. 0.2 M phosphate buffer에 0.6% casein을 용해한 후 pH를 7.0으로 보정하여 기질용액을 제조하였다. 이 기질용액 1.5 mL에 시료추출액 0.5 mL를 넣어 반응(37°C, 10 min) 시 킨 후, 0.44 M trichloroacetic acid(TCA) 2 mL을 가하여 반 응을 정지시켰다. 25분간 37°C water bath에서 방치시킨 후 여과(Whatman No. 2)하였다. 여액 1 mL에 0.55 M Na2CO3 용액 5 mL를 첨가한 후, folin 시약 1 mL를 첨가하여 발색 (37°C, 20 min)시켜서 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 반 응 후 분해물의 tyrosine 양은 tyrosine 표준곡선으로부터 계산 하였으며, 효소 활성은 시료 1 g에 의해 1분간 tyrosine 1 μg 을 생성하는 능력을 1 unit으로 하였다.

    Cellulase 활성 측정

    Cellulase 활성 측정은 carboxymetyl cellulose sodium salt (CMC)를 기질로 하여 효소와 반응 시킨 후, 유리된 환원당을 3,5-dinitrosalicylic acid acid (DNS)방법(Chae et al., 2000)으로 다음과 같이 측정하였다. 1% CMC(pH 7.0) 용액 0.5 mL와 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) 0.25mL를 넣은 후, 시료 추출액 0.25 mL을 첨가하여, 50°C에서 15분간 반응시킨 후, 3,5-dinitrosalicylic acid acid(DNS) 3 mL를 가하여 반응을 정지 시킨 후, 5분간 끓는 물에 중탕시켜 발색시킨 다음 540 nm에서 흡광도 측정하였다. 대조구는 반응 정지를 먼저 시킨 다음, 위와 같은 방법으로 측정하였다. 효소활성을 시료 1g 의해 1분간 glucose 1 ug을 생성하는 능력을 1 unit으로 정의 하였다.

    아미노태(NO3--N) 질소 함량 측정

    시료추출액 5mL, 중성 formalin 용액 10 mL, 증류수 10 mL 를 넣은 플라스크에 0.5% phenolphthalein 용액 2-3방울을 가 한 후, 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지의 적정양과 시료 추출액 5mL, 증류수 20 mL을 넣은 플라스크에 0.5% phenolphthalein 용액을 2 ~ 3방울을 가한 후, 0.1 N NaOH로 미홍색이 될 때까지 적정양을 이용하여 아미노태 질소 함량을 산출하였다(Chae et al., 2000).

    Amino type nitrogen(%)=(V1–V0)×F×0.0014×D×100/S

    V1 : Titration value of sample (mL)

    V0 : Titration value of blank treat (mL)

    F : Facter of 0.1 N NaOH

    D : Dilution ratio

    S : Mass of sample (g)

    0.0014 : Nitrogen weight in 1 mL of 0.1N NaOH (g)

    환원당 측정

    환원당은 dinitrosalicylic acid(DNS) 방법(Chae et al., 2000)에 의하여 측정하였다. 시료 추출액 1 mL에 DNS 3 mL를 혼합한 후 5분 동안 중탕 가열하고 냉각한 후 550 nm 에서 흡광도를 측정하며 glucose standard curve를 통해 환원 당 값을 구하였다.

    Reducing sugar(%)=A×D×1/S×100/1000

    A : Reducing sugar content in sample solution (mg)

    D : Dilution ratio

    S : Mass of sample (g)

    암모니아태(NH4+-N) 질소함량 측정

    아미노태 질소함량 측정 때와 동일한 시료추출액 0.1 mL 취한 후 phenol-hypochloride 반응에 의하여 시료 추출액 0.1 mL에 A용액(phenol 10 g과 sodium nitroprusside dihydrate 0.05 g/distilled water 1 L)과 B용액(Na2HPO4·12H2O 9 g, NaOH 6 g과 NaOCl 10 mL/distilled water 1 L)을 각각 2 mL씩 넣 고 37°C에서 20분간 반응시켜 630 nm에서 흡광도를 측정하 였으며, 표준곡선은 (NH4)2SO4 를 사용하여 암모니아태 질소 함량을 측정하였다(Weatherburn. 1967).

    호기적 균 및 혐기적 균 측정

    청국장 시료를 10배 단계 희석한 후, 호기적 균수는 plate count agar(Difco, Detroit, MI, USA)에 호기조건에서 37°C, 24시간 동안 배양하였으며, 혐기성 총균수는 MRS agar(Difco, Detroit, MI, USA)를 이용하여 혐기 조건에서 37°C, 48시간 동안 배양하여 계수하였다.

    Isoflavone 분석

    청국장은 동결건조 시킨 후 곱게 분쇄하여 40 mesh sieve 를 통과시켜 사용 하였다. 이소플라본 분석을 Wang의 방법을 사용하였다(Wang et al., 1990). 즉, 동결건조 분말 2 g에 acetonitrile 24 mL 과 1 mol HCl 6 mL로 실온에서 1시간 추 출하였으며 filtration (Whatman No. 2) 시켜 3차 증류수로 2 배 희석 하여 0.2 μM membrane filter로 filtration시켜 UPLC (Waters, MA, USA)로 분석하였다. UPLC는 Waters Acquity system을 사용하였으며, column은 Acquity UPLC ?HSS C18 1.8 μm × 2.1 × 75 mm column, 이동상은 0.1% acetic acid를 함유한 10% MeOH(용매A)와 0.1% acetic acid를 함유한 MeOH(용매B)을 사용하였다. 용매 gradient는 용매 B의 농도 를 17분간 26%에서 50%로 증가시켰고, 유속은 0.3 mL/min, injection volume은 0.8 μL, UV detector 파장은 254 nm였다.

    통계처리

    본 실험에서 얻어진 결과는 자료 처리는 SPSS program (12.0, SPSS Inc. Chicago, IL, USA)을 이용하여 실시하였으 며, 각 항목에 대한 평균(mean) 및 표준편차(standard deviation, SD)를 산출하였다. 각 청국장간 차이는 p<0.05 수준에서 oneway ANOVA를 실시하였으며, Duncan's multiple range test 로 그 유의성을 검증하였다.

    결과 및 고찰

    α-amylase 활성

    전분을 분해하는 효소인 α-amylase 활성은 환원당으로 유리 하는데 관여하여 단맛에 영향을 주는 요인이다. 콩에는 β- amylase가 존재하여 발아 시 전분을 maltose로 분해하지만, 삶 아서 사용하므로 실활되고, 세균이 발생하여 분비하는 α-, β- 및 gluco-amylase가 전분을 가수분해하여 환원당을 증가 시킨 다(Ann. 2011). 본 연구의 α-amylase 효소활성 측정 결과는 Table 1과 같다. 대조군과 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8 각각의 균주를 접종한 청국장의 활성을 비교하였을 때 19.65 ± 0.30 unit/mL, 31.19 ± 0.24 unit/mL, 29.22 ± 0.75 unit/ mL, 17.5 1 ±0.17 unit/mL로 HJ25-8을 제외한 나머지 균주를 접종하여 제조한 청국장에서 대조군에 비해 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9은 높은 효소활성 결과를 나타내었다.

    이 등(Lee et al., 2014)은 Bacillus subtilis 균을 접종하여 α-amylase활성을 측정한 결과 11.45 ~ 29.70 units/mL로 본 실 험과 유사한 결과를 나타내었다. 또한 Oh & Eom (2008)은 발아콩 볏짚 청국장의 경우는 발효 24시간에는 12.5 units/g으 로 최대 활성을 나타냈으나 그 이후부터 발효종료까지 감소하 는 경향을 보였다. (Kim et al., 2006). 이는 α-amylase에 의 해 원료의 전분기질이 고갈됨에 따른 것으로 사료된다.

    이처럼 스타터의 종류와 발효조건에 따라 발효와 직접적으 로 관계가 있는 효소들의 활성에 차이가 있는 것으로 보아 청 국장의 품질 및 관능적인 특성을 향상시키는 데에는 스타터의 선택이 매우 중요한 것으로 사료된다.

    Protease 활성

    Protease는 발효 시 단백질을 분해하여 특유의 구수한 맛 성 분인 유리아미노산 함량에 영향을 미친다(Jang et al., 2000; Kim et al., 2007). 본 연구에서 다른 균주를 이용하여 제조한 청국장의 protease 효소활성의 결과는 Table 1과 같다. 48시간 발효 후 대조구, Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8 접종 청국장이 각각 378.80 ± 10.82, 399.47 ± 10.97, 251.80 ± 6.24, 358.13 ± 6.66 unit/mL로 Bacillus subtilis HJO-2접종 청국장이 가장 높은 활성을 나타냈다. 이 등(Lee et al., 2008) 의 발효 균주에 따른 청국장의 발효특성에 관한 연구에 따르 면 실험에 사용되어진 Bacillus sp. B-59의 protease 활성이 대조구보다 높았으며 발효 48시간째 각 처리구별 protease 활 성의 범위는 90.97 ~ 117.19 unit/mL를 나타내었다. 이러한 결 과로 볼 때 본 실험에 사용되어진 균주가 대체적으로 더 높은 활성을 보이는 것을 알 수 있다. Lee et al., (1991)은 다양 한 균주를 이용한 청국장 제조실험에서 발효 72시간까지 protease 효소 활성이 계속 증가되었으며, Choi et al.(1997)은 청국장에서 숙성 7일까지 protease활성의 증가를 보이다 이후 감소한다고 보고하였다. 이러한 결과에 근거하여 볼 때 숙성 기간을 늘릴 경우 protease 활성은 더 증가 될 가능성이 있다 고 사료된다.

    Cellulase 활성

    Cellulase중 특히 CMCase (carboxymethyl cellulase, Endo β-1,4-glucanase, exo-β-1,4-glucanase)는 exo-β-glucanase, β- glucanase와 함께 cellulase계 구성효소로서 식물세포벽 구성성 분 중 대부분 차지하고 있는 cellulose을 분해할 수 있는 능력 을 가지고 있어 장내 이용성 증진을 위해 널리 사용되는 효소 이다. Ra et al. (2004)은 전통 장류인 된장이나 간장은 발효 과정에서 미생물의 전통장류인 된장이나 간장은 발효과정에서 미생물의 다양한 효소(amylase, protease, cellulase 및 lipase) 에 의해 콩에 함유된 단백질, 올리고다당류, 이소플라본, 지질 등이 소화되기 쉬운 형태의 아미노산, 유리당, 이소플라본 아 글리콘, 지방산 등으로 분해되어 항산화 및 혈전용해 기능을 갖는 2차산물이 생성된다고 하였다. 본 실험에서는 Table 1의 결과와 같이 대조구와 Bacillus subtilis HJ18-9, HJ25-8가 각 각 1080.83 ± 19.42 unit/g, 1028.33 ± 84.13 unit/g, 958.33 ± 73.88 unit/g 으로 높은 활성을 나타내었다. 다른 효소활성에 비해 비교적 cellulase의 활성은 더 높은 값을 나타났으며, 따 라서 높은 효소활성을 나타낸 3가지 처리구에서 높은 이소플 라본 아글리콘 함량을 기대할 수 있다.

    아미노태 질소함량

    발효과정 중 콩 단백질은 protease에 의해 아민노산으로 분해 되며(Lee et al., 2013), 아미노태 질소는 유리 아미노산의 아미노 기의 질소나 carboxyl group을 측정하는 것으로 유리되는 아미노 산이 많으면 증가하게 된다(Koo et al., 2014). 본 연구에서 아미 노태 질소 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 대조구에 비해 Bacillus subtilis HJO-2 접종구에서 함량이 161.00±13.79 mg% 가장 높게 측정되어 대조구와 비교하여 유의적인 차이를 나타내 었다. Ryu et al. (2001)에 의하면 밀된장의 발효숙성 과정 중 아미노태 질소 함량 변화를 관찰한 결과 초기 아미노태 질소는 106.48 ~ 162.51mg%으로 나타났으며, Lee et al. (2014)은 아미 노태 질소 함량이 88.20 ~ 118.40 mg%의 범위로 분석되었음을 보고 하였고, Lee et al. (2002)은 품종별로 아미노태 질소 함량 이 다름을 보고하였다. Rho et al. (2008)은 아미노태 질소의 수 준은 제조과정에서 대두단백의 변성도, 관여 발효 미생물의 생 육과 효소 생성 조건 그리고 보관 및 숙성 조건 등 여러 가지 요인에 의해 달라진다 하였으며 따라서 모든 시료에서 전반적으 로 아미노태질소 함량이 낮은 것은 발효시간이나 온도와 같은 환경과 사용한 균주에 의한 영향인 것으로 사료되었다.

    암모니아태 질소함량

    암모니아태 질소함량은 단백질 분해과정에서 탈아미노반응 에 의해 생성되며 함량이 증가할수록 이취와 함께 불쾌감을 준다. 따라서 일반적으로 장류제품의 변패 또는 이상발효의 지 표로써 이용된다(Lee et al., 2014). Protease에 의해 청국장의 구수한 맛이 생성됨과 동시에 암모니아태질소가 형성되기 때문 에 아미노태질소와 암모니아태 질소는 유사한 결과를 보인다. Lee et al. (2014)은 그 범위가 95.09 ~ 137.56 mg%으로 본 실 험의 암모니아태 질소함량은 대조구의 함량 95.10 ± 1.09 mg% 에 비해 Bacillus subtilis HJO-2에서 106.89 ± 3.73 mg%으로 높은 함량을 나타내었으며, HJ18-9, HJ-25-8 아미노태 질소 함량은 각각 94.16 ± 2.38, 87.71 ± 1.48 mg%으로 대조구에 비 해 낮은 함량을 나타내었다. 이는 Bacillus subtilis HJO-2를 접종하여 제조한 청국장은 숙성도가 빠르지만 이취의 발생과 이상발효를 예상해 볼 수 있다. Choi (1997)의 연구에 따르면 B. subtilis를 이용한 청국장을 40°C에서 숙성 시 아미노태 질 소 함량이 숙성 60시간에 576 mg%까지 증가하였으나 그 이 후에 감소하였다고 보고하였다. 본 연구에서는 이와 비교하였 을 때 적은 함량을 나타내었다.

    환원당 함량

    환원당은 단맛을 부여하는 물질로 관능적인 품질평가에 중 요시되는 지표중 하나이다. 환원당의 증가는 계속적인 amylase 의 작용으로 전분이 dextrin으로 dextrin이 maltose와 glucose 로의 분해과정을 거쳐 생성되어 증가한다. Bacillus subtilis는 α 또는 β-amylase를 생성하여 청국장 발효 중 대두중의 전분 을 당으로 전환 시키며, 생성된 당은 청국장의 단맛에 중요한 인자로 작용한다(Ryu. 2001). Byun et al. (2014)은 된장의 환 원당이 높으면 당이 유기산으로 넘어가는 것을 지연시키고, 소 비자 기호도는 낮아진다고 하였다.

    Kim et al. (1995)은 발효 4 ~ 8시간째에 최대의 환원당 함 량을 나타내었다가 그 이후로는 감소하는 경향을 보였다라고 하였다. 본 연구에서는 48시간동안 배양한 청국장의 환원당을 측정하였고 그 결과는 Table 2와 같다. 대조구는 1.95 ±0.06%로 처리구에 비해 높은 함량의 환원당 함량을 나타내었다. Lee et al. (1991) 1.09 ~ 1.32%의 범위를 나타낸다고 하였는데, 이는 본 실험 결과보다 낮은 결과로서 본 실험에서 사용한 균주를 이 용하여 제조한 청국장에서 높은 환원당 함량을 기대할 수 있다.

    미생물 수의 변화

    37°C에서 48시간 동안 발효시킨 청국장의 호기적 총균수는 Fig. 1에 나타내었다. 대조구와 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8의 호기적 총균수는 8.43 ± 0.15, 7.59 ± 0.11, 8.23 ± 0.00 log CFU/mL, 8.09 ± 0.02 log CFU/mL로 나타났다. 또한 청국장의 유산균 수는 청국장 제조에 첨가한 B. subtilis HJ18-9은 메밀 속성장에서 분리한 균주로 Salmonella entericaStaphylococcus aureus, Candida albicans에 대해 항균력 이 우수하다고 보고되었다(Lee et al., 2011). 이와 유사하게 HJO-2균주와 HJ25-8 균주도 같은 항균력을 기대해 볼 수 있 다. 발효가 진행 후 대조구에 비해 적은 값을 나타낸 것은 이 러한 선별된 B. subtilis 균주의 뛰어난 항균성에 의한 것으로 생각된다. 또한 청국장의 혐기적 총균수는 8.27 ± 0.19 log CFU/mL, 7.29 ± 0.08 log CFU/mL, 7.89 ± 0.07 log CFU/mL, 7.87±0.04 log CFU/mL로 나타내었다. 총균수와 비교해 볼 때 0.16 - 1.35 log CFU/mL이 작은 수로 거의 혐기성 균은 유백 색의 동그란 균체가 형성되었다. 따라서 대부분의 혐기성 균 은 유산균으로 예상되며, 호기적 총균수와 비슷한 수준으로 많 이 분포함을 알 수 있었다.

    Isoflavone 함량 변화

    37°C에서 48시간 동안 발효시킨 청국장의 이소플라본함량은 Table 3에 나타내었다. IIsoflavone은 체내 이용률이 낮은 daidzin, glycitin, genistin 등 배당체와 체내 이용률이 높은 daidzein, glycitein, genistein 등 비배당체의 형태로 존재(Ko et al., 2014)한다. 배당체 형태의 isoflavone은 경구로 섭취된 후 당이 제거되어 aglycone형태로 체내에서 흡수되거나, 장내 미생물에 의해 파괴되기 때문에 aglycone형태로 섭취할 시에 는 더 높은 생리활성을 나타낼 것으로 생각된다(Kim. 2009). 이처럼 isoflavone은 glycosided conjugate(malnonylglycoside, β-glycosides 및 acetylglycosides 형태)의 isoflavone isomer와 aglycone 형태로 존재 하는데 대두의 수침이나 가열 등의 가 공처리를 하면 용출된 β-glycosidase의 작용에 의해 aglycone 으로 전환되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 메 밀속성장에서 분리한 β-glucosidase 활성이 있는 3가지 균주를 첨가하여 발효함으로써 aglycone 전환율을 높이고자 하였으며 청국장 발효에 따른 비배당체 함량 변화를 살펴보았다.

    본 연구에서 측정한 isoflavone 함량은 대조구와 Bacillus subtilis HJO-2, HJ18-9, HJ25-8의 isoflavone 비배당체 형 태인 daidzein과 genistein, glycitein을 합한 함량은 각각 141.60 ± 5.90 μg/g, 118.63 ± 10.25 μg/g, 187.00 ± 2.85 μg/g, 210.77 ± 11.75 μg/g으로 Bacillus subtilis HJ18-9, HJ25-8 접종 구의 경우 대조구에 비해 1.32~1.49배 높은 함량을 가지고 있음을 알 수 있었다. 대두의 식품 제조공정 중 비배당체 형 태를 증가시키기 위해서는 천연물 유래의 β-glucosidase 효소 를 활용하는 경우가, 고온이나 강산에 의한 반응산물이 무작 위적이고 부반응에 의해 효율이 저하될 수 있는 방법에 비해 더 반응산물의 선택성을 증가시킬 수 있다(Yang et al., 2007). 따라서 별미장으로 분리된 β-glucosidase 활성이 있는 Bacillus subtilis 균주를 접종하여 청국장을 제조함으로써 isoflavone 비배당체 함량을 유의적으로 증가시키는 결과를 얻 어낸 본 실험은 많은 활용도가 있을 것으로 사료된다.

    적 요

    본 연구는 청국장 제조 시 Bacillus subtilis HJO-2, 18-9와 HJ25-8의 3가지 균주를 starter로 접종하여 발효시킨 청국장의 품질특성과 Isoflaveone의 함량을 측정하였다. 환원당을 유리 하는데 관여하는 α-amylase 효소활성의 경우 Bacillus subtilis HJO-2와 HJ18-9 접종구에서 대조구보다 높은 활성을 보였다. 청국장의 단백질을 분해하여 특유의 구수한 맛 성분을 유리하 는 protease 활성의 경우 Bacillus subtilis HJO-2, 대조구, HJ25-8, HJ18-9의 순으로 높은 활성을 나타내었다. 아미노태 질소와 암모니아태질소의 함량은 Bacillus subtilis HJO-2 접종 구에서 높았으며, 청국장 isoflavone 비배당체 함량은 Bacillus subtilis HJ18-9과 HJ25-8접종구에서 187.00±2.85, 210.77 ± 11.75 μg/g으로 높았다. 이러한 결과로 본 연구를 통해 선별한 균주를 스타터로 접종하여 구수한 맛에 관련된 protease, 아미 노태질소, 환원당의 높은 값을 기대하기 위해서는 Bacillus subtilis HJO-2를 접종하여 청국장을 제조해야 하며, 체내이용 률이 높은 isoflavone aglycone의 값을 기대하기 위해서는 Bacillus subtilis HJ18-9과 Bacillus subtilis HJ25-8등으로 제 조하는 것이 바람직하다. 청국장 제조에 알맞은 균주를 개발, 평가하여 가공품으로 개발의 기초연구가 되고자 하였다.

    Figure

    KSIA-27-481_F1.gif

    Change of microbial counts of Cheonggukjang prepared by different strains.

    Table

    Changes in enzyme activities during chungkookjang fermentation by four different strains.

    Means in the same rowa-d followed by different letters are significantly different (P<0.05).

    Changes in amino-type nitrogen, ammonia-type nitrogen and reducing sugar contents during Chungkookjang fermentation by four different strains. (n=X±SD)

    Means in the same rowa-c followed by different letters are significantly different (P<0.05).

    Isoflavone contents (ug/g dry matter) in Chenggukjang prepared by different strains. (μg/g)

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