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ISSN : 1225-8504(Print)
ISSN : 2287-8165(Online)
Journal of the Korean Society of International Agricultue Vol.26 No.2 pp.157-161
DOI : https://doi.org/10.12719/KSIA.2014.26.2.157

Contamination of Plasmodiophora Brassicae on Soil in Highland Area of Chinese Cabbage Cultivation

Jae-Woo Soh, Kyung-Sook Han†, Seong-Chan Lee, Jong-Han Park
Department of Horticultural Environment, National Institute of Horticultural and Herbal Science, Suwon, 440-706, Korea
Corresponding Author : (Phone) +82-31-290-6233, kshan9@korea.kr
February 5, 2014 April 14, 2014 April 14, 2014

Abstract

This research was performed to establish basic technology of chemical control and the degree of contamination of P. brassicae by researching the soil contamination of the regions well known as the major producer of summer Chinese cabbage. As places well known for summer Chinese cabbage, 12 out of 15 in Pyeongchang-gun. Seven out of 11 regions in Samcheok-si and Taebaek-si resulted positive for P. brassicae contamination. It was found out that the soil contamination rate of P. brassicae was 80 % in Pyeongchang-gun, 63.6 % in Samcheok-si and Taebaek-si. The 10 places where the Chinese cabbage clubroot was verifiable by naked eye were 100 % confirmed by the PCR test of the P. brassicae soil contamination. Thus, the P. brassicae soil contamination could be diagnosed by the simple PCR test and it could be utilized as an index for deciding chemical control.


고랭지 토양의 배추뿌리혹병 오염

소 재우, 한 경숙†, 이 성찬, 박 종한
국립원예특작과학원 원예특작환경과

초록


    강원도

    평창군과 강릉시 경계에 걸친 안반데기 지역과 태 백 및 삼척 지역이 국내 여름배추의 주요 재배 산지이다. 이들 지역은 산간 지역의 서늘한 기후로 인하여 Erwinia carotovora 에 의한 무름병과 Turnip mosaic virus(TuMV)의 발생을 회피 할 수 있다. 하지만 최근 이들 지역에서 배추 연작재배와(Lee, 2004) 친환경 농법이 확대되면서 Plasmodiophora brassicae에 의한 배추뿌리혹병 피해가 증가하고 있다(Jung et al., 2007). 특히 2005년 여름배추의 주산지로 알려진 강원도 지역은 재배 면적의 9%에 이르는 692ha에서 배추뿌리혹병이 발생한 것으 로 보고되어 있다(Yoon et al., 2010). P. brassicae는 배추과 작물 B. oleracea, B. napus, B. rapa(Buczacki and Ockendon, 1979)와 B. nigra, B. juncea, B. carinata(Vaughan, 1977) 뿐 만 아니라 배추과 잡초 Sinapis alba, Thlaspi arvense(Dixon, 2009)와 Capsella bursapastoris(Buczacki and Ockenodon, 1979)에서도 뿌리혹병을 유발시키는 것으로 알려져 있다. P. brassicae에 의해 배추뿌리혹병에 이병된 배추는 뿌리 조직의 유관속부가 분화되지 않고 이상 비대하여 양분과 수분을 흡수 하기 위한 세근이 발생하지 못하게 된다(Feng et al., 2012). 따라서 지상부는 극심한 위조 증상을 반복하면서 결구가 되지 않거나 당도가 저하되고 식감이 질겨져 품질이 급격히 저하된 다(Jang et al., 2001; Kim and Oh, 1997). P. brassicae에 이병된 배추 뿌리는 이상 비대가 더욱 진전되어 배추 뿌리의 고유한 형태를 상실하고 온도 환경 조건에 따라 근 부패도 함 께 수반한다(Kim et al., 2000a). 이 과정에서 뿌리 조직내 있 던 휴면 포자가 밖으로 방출되고 토양에서 15년 이상 생존하 면서 배추 재배지에서 뿌리혹병을 지속적으로 유발시킨다 (Mattush, 1977). 이러한 특성 때문에 배추뿌리혹병의 방제는 매우 어려우며 배추 주산지에서 연작 재배를 하는 국내 농업 생산현장에서 amisulbrom나 flusulfamide와 같은 토양 소독제 를 많이 사용하고 있다(Kim et al., 2002). 강원도 지역의 배 추 재배에 사용되는 화학적 방제 비용은 2005년 3,500ha당 약 25억원으로 보고되고 있다(Lee, 2007). 이러한 토양 살균제의 과다 사용과 관행적 연용으로 인하여 P. brassice의 병원성 분 화가 나타나고 있다(Park et al., 2004). 하지만 여름배추 주산 지 토양의 P. brassicae의 오염 정도와 실태 연구가 보고되지 않은 실정이다. 따라서 고가의 토양 살균제를 사용할지 여부 를 배추 재배 농민에게 과학적 근거를 가지고 영농 지도 사업 을 하기 어렵다.

    현재까지 P. brassicae 검출을 위한 특이적 primer가 보고되 어 있지만 genomic DNA에 대한 검출 민감도가 떨어지고 토 양시료에 대한 적용과 배추 주산지 토양의 P. brassicae에 의 한 오염 정도가 보고되지 않았다(Ito et al., 2001). 토양병의 효과적인 PCR 진단을 위하여 토양시료에서 genomic DNA의 직접적인 추출에 관한 일반적인 연구는 CTAB 추출법(Zhou et al., 1996), 미생물의 genomic DNA 추출을 응용하는 방법 (Lee and Taylor, 1990), PEG 분리법(Yeates, 1998), Yeates 의 방법을 응용한 genomic DNA 분리법(Kang et al., 2005) 등이 보고되어 있다. 따라서 본 연구는 여름배추 산지로 알려 진 강원도 고랭지 배추 산지의 토양내 P. brassicae의 오염 정도를 PCR 분석하여 배추뿌리혹병 방제 및 지도 사업에 과 학적 근거를 마련하여 이와 관련한 기초 기술을 확립하고자 한다.

    재료 및 방법

    국내 여름배추 주산지로 알려진 강원도 지역에서 평창군 15 곳, 삼척시 및 태백시 11곳 총 26곳의 배추 재배포장에서 임 의로 10점을 선정하여 표토 5cm을 걷어낸 후 30g씩 채집하 였다. 수집해온 토양은 상온에서 음건한 후 시료 10 g과 멸균 수 10 ml를 혼합하여 25°C, 150 rpm에서 10분간 교반하였다. 현탁상태가 된 토양시료는 다시 마쇄한 후 상등액 1ml를 10,000 rpm, 5분간 원심분리하여 상등액을 분석 시료로 사용 하였다. lysis buffer 400 μl를 넣고 항온기에서 65°C에 1시간 동안 반응시킨 후 1:1의 phenol과 chloroform을 400 μl 넣고 혼합하였다. 상온에서 10,000 rpm로 15분간 원심 분리한 다음 새 튜브에 상층부를 옮겼다. 3M NaOAc 10 μl와 상층액의 0.54배 isopropanol을 넣은 후 수회 세척하였다. 다시 실온에서 2분간 10,000 rpm 로 원심 분리한 후 상층액을 버리고 70% ethanol로 washing 하였다. Vacuum dry로 pellet을 건조한 후 TE로 침전물을 용해한 다음 DNA의 농도는 1.0 μg· μl-1로 희 석하였다. P. brassicae 특이적 primer는 National Center for Biotechnology Information(NCBI)에서 beta-tubulin 유전자를 참고하여 Lasergene(Version 7.1, DNASTAR Inc., USA)을 이 용하여 primer를 제작하였다. PCR 조성은 추출한 1.0 μg· μl-1 genomic DNA 0.4 μl, 국립원예특작과학원에서 배추뿌리혹병 진단용 primer(Han et al., 2012)으로 개발한 Pb01F(5’- caaggtgacgatcacgaatg-3’)과 Pb01R(5’-ctcacgaatgagtgcacctg-3’) 5 pmoles· μl-1 primer를 각각 0.4 μl씩 PreMix(AccuPowers Taq PCR PreMix, Bioneer Co., Korea)에 넣은 다음 총 볼 륨을 20 μl에 맞췄다. PCR(PTC-200, Bio-Rad, USA) 조건은 denaturation 95°C에서 5초, annealing 60°C에서 5초, extension 72°C에서 20초를 40회 수행한 다음 전기 영동(Mupid-ex, TaKaRa code AD100, USA)은 1.2% agrose gel을 조제하여 100 mV에서 50분간 실험한 후 형광 반응은 loading dye (Loading Star, Dynebio Co., Korea)를 이용하였다.

    결과 및 고찰

    본 실험에서 사용한primer의 P. brassicae에 대한 특이성을 검정하였다(Fig. 1). 개발한 Pb01F와 Pb01R 세트를 이용하여 토양병을 유발하는 병원균 P. brassicae 5종, Fusarium spp. 2종, Rhizoctonia spp. 2종, Cladosporium spp. 1종, Verticillium spp. 2종, Pythium spp. 2종, P. capsici 1종, P. nicotiauae 1종, 배추 재배지에서 분리한 세균 및 진균 11종의 genomic DNA을 추출하여 비교하였는데, 5종의 P. brassicae 균주에서만 반응하였다.

    개발된 primer의 P. brassicae의 genomic DNA 농도에 대 한 검출도를 검정하였다(Fig. 2). P. brassicae의 genomic DNA 농도를 10 ng에서 10 fg까지 테스트 한 결과 100 fg 의 genomic DNA를 검출할 수 있는 것으로 나타났다. 기존의 P. brassicae 특이 primer로 알려진 PbITS1 및 PbITS2 세트 는 1 pg까지 검출 가능하고(Ann-Caharlotte and Ola, 2001), TC1F 및 TC2R 특이 primer 세트는 100fg까지 검출할 수 있다고 보고되어 있는데 (Tiesen et al., 2007), 이번에 개발된 Pb01F 및 Pb01R primer 세트는 TC1F 및 TC2R 세트와 동 일한 수준의 높은 민감도를 보이면서 생산물의 크기는 245bp 로 나타났다.

    여름배추의 재배 산지로 알려진 평창군, 삼척시와 태백시의 토양내 P. brassicae에 대한 PCR 검정을 수행하였다(Fig. 3). 평창군은 조사지역 15곳 중 12곳, 삼척시와 태백시는 11곳 중 7곳이 P. brassicae에 오염된 것으로 나타났다. 이들 지역의 P. brassicae에 의한 토양 오염을 살펴보면 평창군 80.0%, 삼척시 와 태백시는 63.6%로 나타났다(Table 1). 강원도 여름배추산 지의 토양내 잔효 비료량과 잔류농약을 조사한 결과 비료와 농약이 관행적으로 연용되어 사용되며(Lee, 2004), 평창군, 정 선군 및 태백시 지역의 토양 총 240점을 조사한 결과 조사지 역의85%에서 dimethomorph, 조사지역의 30%이상에서 fluazinam이 검출된 것으로 보고되어 있다(Park et al., 2004). 이는 현재 농가에서 fluazinam 분제가 배추뿌리혹병의 화학적 방제로 널리 사용되고 있기 때문이다(Zhang et al., 2005). 즉 여름배추 주산지로 알려진 강원도 지역의 토양은 P. brassicae 에 의한 뿌리혹병 오염이 매우 높다는 것이 확인되었고, 이로 인한 배추뿌리혹병의 발생 및 재감염이 해마다 반복되기 때문 에 종자 소독제 및 토양 살균제의 연용과 과다 사용이 관행적 으로 이루어지고 있는 것으로 생각된다.

    평창군, 삼척시 및 태백시의 배추 경작지는 대부분 산간지 역으로 토양침식 및 유거수 유입 등으로 배추뿌리혹병의 피해 가 늘고 있다(Fig. 4). 강원도의 여름배추 재배지역은 평균 해 발 580m에서 경사도 21% 의 산간 토양으로 대부분 경사지로 되어 있어 토양침식으로 인한 양수분 유실이 높은데(Lee, 2004), 이처럼 경사에 따른 유거수의 유입으로 P. brassicae의 유주자가 뿌리 조직세포를 감염되기 유리한 환경이 조성된다 (Ingram and Tommerup, 1972). 고랭지 지역의 배추 산지의 농업 생산환경 연구에서 토양 pH도 약 5.72-5.85로 다른 지역 보다 낮은 것으로 보고되어 있는데(Park et al., 2004), 이는 휴면포자의 발아율(Kim et al., 2000b) 과 뿌리혹의 이상 비 대(Kim et al., 1999)가 가장 활발한 토양은 pH 6.0에 근접 하는 것이다. 따라서 강원도 여름배추 재배 산지의 경사 지형 은 토양침식, 양이온 유실, 낮은 토양pH의 농업 생산 환경을 보이며, 따라서 토양내 P. brassicae의 오염 및 배추뿌리혹병 의 발생을 증가시킨 것으로 생각된다.

    여름배추 재배 산지의 토양시료 채취시 배추뿌리혹 발생 조 사결과와 PCR 검정 결과를 비교하였다(Table 2). 배추뿌리혹 이 육안으로 확인된 평창군 3곳, 삼척시 및 태백시 7곳의 PCR 검정 결과에서 토양내 P. brassicae에 모두 오염된 것으 로 나타났다. 반면 현지조사에서 육안으로 배추뿌리혹이 확인 되지 않았지만 평창군의 8곳의 토양은PCR 검정 결과 P. brassica에 오염되었고, 삼척시 및 태백시에서 뿌리혹이 확인 되지 않은 4곳의 토양은 P. brassicae의 오염되지 않은 것으로 나타났다. 평창군에서 배추뿌리혹의 육안검사 결과와 PCR 검 정 결과가 차이를 보이는 것은 토양내 P. brassicae가 존재하 지만 PCR 검정 특성상 병원균의 활성 유무와 상관없이 genomic DNA에 따라 나타나기 때문으로 생각된다. 특히 평 창군의 경우 배추의 재배기간에 토양내 잔류농약이 fluazinam 및 그 외 12종의 살충제 및 살균제가 0.004 - 0.412 mg·kg-1이 검출되었다고 하였다(Park et al., 2004). 따라서 현재 농가에 서 널리 사용되는 화학적 방제 중 하나인 fluazinam 분제의 사용에 따른 것으로 fluzainam 분제의 처리시 휴면포자의 밀 도가 처리 전과 비교하여 36.6% 정도 감소하는데(Zhang et al., 2005), 강원도 지역의 fluazinam과 같은 토양 살균제의 연 용은 P. brassicae의 병원균 밀도를 낮추었을 것으로 생각된다.

    이상의 결과로 볼 때 여름배추 재배 주산지인 강원도 지역 의 토양내 P. brassicae에 대한 토양 오염 정도가 매우 높은 것으로 확인되었다. 따라서 현재 농가에서 fluazinam을 비롯한 화학적 방제약의 연용과 과다 사용을 할 수 밖에 없는 것으로 나타났다. 이는 재배 농가 입장에서 P. brassicae에 의한 배추 뿌리혹병 발생과 이에 따른 비용 부담과 위험성에 노출되어 있는 것으로 생각된다. 따라서 배추 주산단지별 P. brassicae 에 의한 토양내 오염 수준을 매년 조사하고 이를 토대로 토양 살균 여부를 판단하는 연구가 필요할 것이다. 아울러 이들 지 역의 P. braasicae 감염 경로와 토양내 생존기간에 대한 이력 조사도 함께 이루어져야 할 것이다.

    적 요

    본 연구는 여름배추 산지로 알려진 지역의 토양내 P. brassicae의 오염 조사를 통하여 병원균의 오염 정도와 화학적 방제의 기초 기술을 확립하고자 수행하였다. 여름배추 재배지 로 알려진 평창군은 15곳 중 12곳, 삼척시와 태백시는 11곳 중 7곳이 P. brassicae에 오염된 것으로 나타났다. 토양내 P. brassicae에 의한 오염률은 평창군 80.0%, 삼척시와 태백시 63.6%로 나타났다. 배추뿌리혹이 육안으로 확인된 10곳은 PCR 검정에서 토양내 P. brassicae가 100% 확인할 수 있었 다. 따라서 토양내 P. brassicae의 오염을 PCR 진단을 통해 화학적 방제를 결정할 수 있는 지표로 활용할 수 있을 것이다.

    추가 주요어: 베타 튜불린, 뿌리혹병, Genomic DNA, 중합 효소 연쇄반응, 프라이머

    Figure

    KSIA-26-157_F1.gif

    Ethidium bromide stained 1.2% agarose gels of polymerase chain reaction (PCR) products amplified with primers Pb01F and Pb01R from genomic. Lane 1 : 100bp DNA ladder, lane 2-6 : P. brassicae, lane 7 and 8 : Fusarium spp.,. lane 9 and 10 : Rhizoctonia spp., lane 11 : Cladosporium spp., lane 12 and 13 : Verticillium spp., lane 14 and 15 : Pythium spp., lane 16 : P. capsici, lane 17 : P. nicotiauae, lane 18-28 : soil microbes (fungi and bacteria) from Chinese cabbage field.

    KSIA-26-157_F2.gif

    Ethidium bromide stained 1.2% agarose gels of polymerase chain reaction (PCR) products amplified with primers Pb01F and Pb01R from genomic NA from a 10 fold serial dilution of purified P. brassicae genomic DNA. DNA was serially diluted from 10ng to 1 fg with 1 Ⅹ Tris-ethylene-di-aminetetra-acetic acid buffer and used as a template for PCR. Lane 1: DNA ladder, lane 2: 10 ng of P. brassicae template DNA, lane 3: 1 ng of template DNA, lane 4: 100 pg of template DNA, lane 5: 10 pg of template DNA, lane 6: 1 pg of template DNA, lane 7: 100 fg of template DNA, lane 8: 10 fg of template DNA, lane 9: 1 fg of template DNA, and lane 10: sterile distilled water negative control.

    KSIA-26-157_F3.gif

    Ethidium bromide stained 1.2% agarose gels of polymerase chain reaction (PCR) products amplified with primers Pb01F and Pb01R from genomic DNA from Plasmoidophora brassicae in soil. Lane 1 : 100bp DNA ladder, lane 2-16 : soil of Pyeongchang-gun, lane 17-27 : soil of Samcheok-si and Taebaek-si.

    KSIA-26-157_F4.gif

    Summer plantation field of Chinese cabbage(left) and symptoms of clubroot by P. brassicae(right).

    Table

    Comparison of soil contamination rate in each Chinese cabbage plantation.

    Comparison of visual test and PCR amplification products.

    zPC : Pyeongchang-gun, ST : Samcheok-si and Taebaek-si.
    y− : negative reaction on PCR amplification
    x+ : positive reaction on PCR amplification

    Reference

    1. Ann-Charlotte W , Olam A (2001) Detection of Plasmodiophora brassicae by PCR in naturally infested soils , Euro. J. Plant Pathology, Vol.107; pp.313-321
    2. Buczacki S.T , Ockendon J.G (1979) Preliminary observations on variation in susceptibility to clubroot among collections of some wild crucifers , Ann. Appl. Biol, Vol.92; pp.113-118
    3. Dixon G.R (2009) The occurrence and economic impact of Plasmodiophora brassicae and clubroot disease , J. Plant Growth Regulation, Vol.28; pp.194-202
    4. Feng J , Xiao Q , Hwang S.F , Stephen E.S , Bruce D.G (2012) Infection of canola by secondary zoospores of Plasmodiophora brassicae produced on a nonhost , Eur. J. Plant Pathol, Vol.132; pp.309-315
    5. Han K.S , Lee S.C , Han Y.K , Soh J.W , Kim S (2012) Molecular detection of Plasmodiophora brassicae, causal agent of clubroot of Chinese cabbage, in plant and soil , Plant Pathol. J, pp.204
    6. Ingram D.S , Tommerup L.C (1972) The life history of Plasmodiophora brassicae Woron , Proc. R. Soc. Lond. B, Vol.180; pp.103-112
    7. Ito S , Ichinose H , Yanagi C , Tanaka S , Kameya-Iwaki M (2001) Identification of differentially expressed genes in susceptible and resistant responses of Chinese cabbage to Plasmodiophora brassicae , J. Phytopathology, Vol.149; pp.227-231
    8. Jang C.S , Park Y.J , Lim Y.P (2001) Development of antherderived lines resistant to clubroot diseases(Plasmodiophora brassicae Woron.) in Chinese cabbage , J. Kor. Soc. Hort. Sci, Vol.42; pp.689-694
    9. Jung J.M , Yoon B.K , Kim H.J , Seo Y.W , Yang S.K , Choi K.J (2007) The effects on resources of soil amendment matters friendly-environment on the marketing for agriculture of Chinese cabbage , Jour. Bio-Environ. Cont, Vol.16; pp.276-281
    10. Kang J.H , Kim B.H , Lee S.E , Kim Y.J , Lee J.W , Park Y.M , Ahn S.C (2005) Improved genomic DNA isolation from soil , J. Life Sci, Vol.15; pp.851-856
    11. Kim D.W , Oh J.H (1997) Incidence, pathogenicity of clubroot fungus (Plasmodiophora brassicae) and varietal resistance in Chinese cabbage , Koean J. Plant Pathol, Vol.13; pp.95-99
    12. Kim C.H , Cho W.D , Kim H.M (2000a) Some environmental factors affecting decay of root galls in club root disease of Chinese cabbage , Kor. J. Pest. Sci, Vol.4; pp.61-65
    13. Kim C.H , Cho W.D , Kim H.M (2000b) Some environmental factors affecting germination and survival of resting spores of Plasmodiophora brassicae , Kor. J. Pest. Sci, Vol.4; pp.66-71
    14. Kim S.M , Choi H.J , Kim H.Y , Lee D.K , Kim T.H , Ahn M.S , Hur J.H (2002) Survey on pesticide use by Chinese cabbage growers in ganawon alpine farmland , Kor. J. Pesticide Sci, Vol.6; pp.250-256
    15. Lee C.S (2004) Actual condition survey of farms of summer Chinese cabbage on highland , Kor. Soc. Soil & Sci. Fert, Vol.18; pp.9-15
    16. Lee Y.M (2007) High resolution mapping pf molecular marker linked to CRb, a gene resistant to clubroot disease in Chinese cabbage. M.A. Thesis, Choongnam Natl. Univ,
    17. Innis M.A , Gelfand D.H , Sninsky J.J , White T.J (1990) PCR protocols, A guide to methods and applications, Academic press, pp.282-287
    18. Buczacki S.T , Williams P.H (1977) Woronin 100 International conference on Clubroot, Univ. of Wiconsin, Madison, pp.22-28
    19. Park D.S , Kim T.H , Kim S.S , Lee S.M , Kim S.M , Hur J.H (2004) Monitoring of pesticide residues at alpine and slopedland Gangwondo, Korea , Kor. J. Pest. Sci, Vol.8; pp.189-197
    20. Tiesen C , Jalpa T , Stephen E.S (2007) Molecular detection of Plasmodiophora brassicae, causal agent of clubroot of crucifers, in plant and soil , Plant Dis, Vol.91; pp.80-87
    21. Vaughan J.G (1977) A multidisciplinary study of the taxonomy and origin of Brassica crops , Bioscience, Vol.27; pp.35-40
    22. Yeates C , Gillings M.R , Davison A.D , Altavilla N , Veal D.A (1998) Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification , Biol. Proced. Online, Vol.14; pp.140-147
    23. Yoon C.S , Jung E.K , Lee S.J , Zhang Y , Lee J.E , Kim B.S (2010) Screening of resistant Chinese cabbage cultivar against clubroot( Plasmodiophora brassicae) for cultivation in highland , Res. Plant dis, Vol.16; pp.59-65
    24. Zhang X.Z , Lee S.U , Kim J.S , Yoon Y.S , Choi G.S , Kim H.K , Kim B.S (2005) Control efficacy of flusulfamide GR on Chinese cabbage clubroot caused by Plasmodiophora brassicae , Res. Plant Dis, Vol.11; pp.43-47
    25. Zhou J , Bruns M.A , Tiedje J.M (1996) DNA recovery from soils of diverse composition , Appl. Environ. Microbiol, Vol.62; pp.316-322