세계적으로

약 60여종의 바이러스들이 고추에 발생하는 것 으로 알려져 있으며 (Kim and Choi, 2002), 우리나라에서는 고추에 경제적 피해를 일으키는 바이러스들로는 10종이 보고 되었다. 이들 고추 바이러스들 중에서 담배연녹모자이크바이러 스 (Tobacco mild green moaic virus: TMGMV)와 토마토반 점위조바이러스 (Tomato spotted wilt virus: TSWV)는 지역 적으로 발생하고 있고, 알팔파모자이크바이러스 (Alfalfa mosaic virus: AMV), 감자Y바이러스 (Potato virus Y: PVY), 담배모 자이크바이러스 (Tobacco mosaic virus : TMV)와 고추엽맥퇴 록바이러스 (Pepper vein chlorosis virus)들은 최근에는 발생되 지 않는 바이러스 (Kim et al., 1990)이며, 그 외 4종류 바이 러스인 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus: CMV), 잠두위조바이러스2 (Broad bean wilt virus 2: BBWV 2), 고추연한모틀바이러스 (Pepper mild mottle virus: PMMoV), 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus: PepMoV)가 전국적으 로 지속적으로 발생하여 농가에 피해를 주고 있다 (Choi et al., 2005; Kim et al., 2012).

바이러스들에 감염된 고추에서 발견되는 대표적인 병징은 모 자이크이며, 황화, 위축, 괴사, 엽맥녹대, 잎말림, 갈변, 과실 기 형이 나타나며, 병징이 심해지면 세입화하고 식물체가 위축되 어 결국 괴사된다. CMV, BBWV 2, PMMoV, PepMoV 및 TSWV의 효과적인 방제를 위해서는 고추 식물체와 바이러스 보독 매개충을 신속 정밀하게 진단하는 기술을 개발하여 병 발 생 예찰에 이용하는 것이 중요하다. 현재까지 고추 바이러스들 진단에 가장 정확하고 유용하게 사용되는 방법은 Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 방법과 RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 방법이다. ELISA 방법은 시중에서 진단키트 구입이 용이하지만, 진단 감 도가 균일한 항혈청을 이용하기가 어려우며, 항혈청을 지속적 으로 생산하여야 하는 단점이 있으나 대량 진단이 가능하며 기술숙련도가 요구되지 않으며, 비용이 상대적으로 저렴하다 는 장점이 있다 (Hull, 2002). 이러한 ELISA 진단법과 비교 할 때 RT-PCR 진단법은 CMV, BBWV 2, PepMoV, PMMoV 를 동시에 정밀 진단할 수 있어 매우 유용하며 (Cho et al., 2006) 우리나라에 발생하는 고추 바이러스 2종인 CMV, BBWV 2를 동시에 진단할 수 있어 진단 감도의 증대 및 진 단시간을 절약할 수 있어 유용하다. 그러나, 5가지 바이러스들 을 동시에 진단할 수 있는 프라이머들 및 RT-PCR 조건들은 아직 개발되지 못하였다. 고추 바이러스의 유전자 진단법은 동 시에 진단할 수 있는 기술이 개발되어 시판되고 있어 감염된 고추 식물체나 진딧물 등 매개충으로부터 바이러스를 진단하 는데 이용이 가능하다.

그러나 일반적으로, 고추 바이러스들이 감염된 기주 식물 및 보독 매개충에서 바이러스 유전자 진단을 하기 위해서 사용하 는 RT-PCR 키트들은 기주 식물 및 매개충에서 복잡한 RNA 분리 및 정제하는 과정이 필요하다. 또한, RT-PCR에 의한 방 법의 단점 중에 하나는 진단 시료수가 많아지면 진단비용과 소요시간, 기술 숙련도 및 별도의 장비들이 많이 필요하다. 최 근에는 일반적 유전자 진단법의 단점을 극복하기 위하여 간단 하고 빠르게 식물바이러스 진단기술에 대한 연구가 이루어져 왔다 (Li & Mock, 2005; Osman & Rowhani, 2005). RTPCR 진단법을 빠르고 간편하게 개발하려면 진단과정을 크게 줄이는 기술이 필요하며, 특히 RT-PCR 진단 과정 중 시간, 노동력, 비용이 많이 소요되는 핵산 분리과정을 시료로부터 특 별한 분리키트나 시간의 투자 없이 핵산을 간단히 분리하여 진단할 수 있다면 빠르고 간편하게 다량의 시료를 PCR로 진 단할 수 있는 유전자 진단기술이 개발될 수 있는 것이다.

이러한 방법들 중 하나로써, 면역학적 방법을 겸한 IC/RTPCR (Immuno-captured/RT-PCR)은 바이러스 핵산을 따로 분 리할 필요가 없으므로 전체 핵산(total RNA)을 이용한 보통의 고추 바이러스 RT-PCR 진단법에 비해 진단비용을 크게 절감 할 수 있으며, 진단의 정확도를 한층 높임으로서 식물바이러 스 진단에 큰 역할을 하였다 (Nolasco et al., 1993). 그러나 IC/RT-PCR방법은 항체가 반드시 필요하며 항체 처리와 오랜 반응시간이 필요하다는 단점이 있다. 이러한 모든 단점을 극 복하기 위해 항체가 필요 없고 간단하며 빠르게 식물로부터 핵산을 추출할 수 있는 다양한 방법이 개발되었으나 (Suehiro et al., 2005), 고추 바이러스들의 RT-PCR 진단에 활용되고 있지는 않다. 국내에서는 TSWV에 대하여 바이러스 특별한 핵산 분리 과정 없이 간편하고 정확하게 바이러스를 진단하는 virion-captured RT-PCR (VC/RT-PCR) 방법이 개발되었다 (Cho et al., 2006). 그러나 TSWV는 담배종들 (Nicotiana spp.) 에서는 바이러스 입자들 뿐만 아니라 핵산 추출하는 과 정에서는 핵산 분쇄 등이 적으나, 고추에서는 핵산 추출 과정 중 바이러스 RNA들의 분쇄가 빈번하여 새로운 방법으로 TSWV 핵산 추출 방법이 필요하다 (Cho et al., 2006). 또한 DNA 바이러스인 토마토황화잎말림바이러스 (Tomato yellow leaf curl virus: TYLCV)를 검정할 수 있는 VC/PCR 방법이 보고되었다 (Choi et al., 2008). 한편, 여러 종류의 바이러스 진단 프라이머를 조합하여 한번에 여러 바이러스를 동시에 진 단하는 방법들이 개발되었으며 (Sharman et al., 2000) 우리나 라 박과 작물에 가장 피해를 일으키는 종자전염 바이러스 3종 을 동시에 진단할 수 있는 VC/RT-PCR유전자 진단기술을 개 발하여 이용하고 있다 (Cho et al., 2007).

본 연구는 고추 바이러스들 감염 조사 및 매개충의 바이러 스 보독율 조사를 전국적으로 실시하면서 간편한 진단법의 개 발이 시급함에 따라 개발하게 되었으며, 별도의 핵산 분리 없 이 고추 바이러스들을 안정적으로 RT-PCR 검출하기 위한 새 로운 즙액 추출 용액을 개발하여, TSWV, PMMoV 및 PepMoV 다중 진단법인 VC/RT-PCR 유전자 진단법을 보고하 고자 한다.

재료 및 방법

즙액 추출 완충액 조성 및 시료 준비

일반적으로 ELISA와 IC/RT-PCR 진단에서 사용하는 인산액 추출 완충용액 [10mM phosphate buffer (pH 7.0) + 0.5% (w/v) sodium sulfate]를 기본으로 하여, 각 기본 완충용액으로서 농 도가 각각 다른 Tris 추출 용액을 제조하였다(Table 1). 여기 에 분자량이 각각 다른 비이온 계면활성제인 Polyethylene Glycol (PEG)를 각각 5% (w/v)으로 첨가하여 즙액 추출 완 충액을 제조하였다. PMMoV, PepMoV 및 TSWV가 각각 감 염된 담배 (Nicotiana rustica) 및 고추 (청양 품종)으로부터 잎 조직 0.2 g을 미니 막대분쇄기를 이용하여 1.5 mL 폴리프 로필렌 튜브에서 다양하게 조합으로 각각 제조된 즙액 추출 완충액 600 μL을 넣어 마쇄시켰다. 마쇄 즙액은 또한 48시간 동안 실온에서 방치하여 즙액 안정성 및 바이러스들의 존재 여부를 확인하였다.

바이러스 진단 프라이머들 및 VC/RT-PCR 조건

TSWV 진단에 사용된 프라이머들은 777 bp를 증폭할 수 있 는 TSWV-NCP-For (5'-ATGTCTAAGGTTAAGCTCAC-3') 및 TSWV-NCP-Rev (5'-TCAAGCAAGTTCTGCGAGTT-3') 그리 고 PMMoV 진단에 사용된 프라이머들은 412 bp를 증폭할 수 있는 PMMoV-CP-For (5'-TTGCGCAAAAGAAAAAGGTA ATA-3') 및 PMMoV-CP-Rev (5'-CTAGAAGCGGGGAAGTA AGT-3')를 이용하였다. PepMoV 진단을 위하여 327 bp를 증 폭할 수 있는 PMMoV-NIb-For (5'-GCGACCGGCATTTGA GGAAG-3') 및 PMMoV-NIb-Rev (5'-CAATTGGGGCTGCTGT GAAAGTC-3')를 이용하였다. VC/RT-PCR에 이용될 시료 준비 를 위하여 PMMoV, PepMoV 및 TSWV가 각각 감염된 담 배 및 고추로부터 잎 조직 0.2 g을 1.5 mL 폴리프로필렌 튜브 에서 다양하게 조합으로 각각 제조된 즙액 추출 완충액 600 μL 을 넣어 마쇄시킨 후 바이러스 특이적 항체를 첨가 후 얼음에 서 10분동안 방치하였다. 동일한 즙액 추출물로 2회 세척 후 멸균된 3차증류수로 20 μL를 첨가하여 현탁하였다. 바이러스 가 함유된 용액 1μL, AccessQuick™ RT-PCR 키트 (Promega, USA)에서 제공된 2X RT-PCR master mixture 10 μL, 각 프라이머들 (10 pmole) 1 μL, AMV reverse transcriptase (200U/μL) 1 μL 를 넣고 3차 증류수를 6 μL를 첨 가하여 최종 부피를 20 μL로 하여 RT-PCR 반응을 시켰다. RT-PCR 조건은 48°C, 30분 → 94°C, 5분 → (94°C, 20초, 55°C, 30초, 72°C, 1분), 35회 → 72°C, 5분 → 4°, 5분이었다. 증폭된 RT-PCR 산물들은 1.2 % agarose gel 에서 110V 전 압으로 40분간 전기영동 후 ethidium bromide 용액에 담근 후 증류수로 5회 세척 후 자외선을 쬐어 관찰하였다 (Choi et al., 2011).

결과 및 고찰

최적의 즙액 추출 용액 조성의 결정

TSWV는 외피 단백질 외에 envelop이라고 불리는 지질단백 질막으로 구성되어 있어 순화 및 식물 즙액에서 추출 시에 불 안정한 것으로 보고되었으며 (Best, 1968; Sherman et al., 2003). 고추는 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드들 및 다양한 폴리페놀들 및 항산화제들을 포함하고 있어 고추가 마쇄 되었 을 때 즙액 내 TSWV들을 비롯한 PMMoV 및 PepMoV 입 자 및 핵산의 안정성을 크게 저해시키는 것으로 알려져 있다 (Jeong et al., 2011). 따라서 고추 바이러스들을 안정적으로 진단하기 위하여 새로운 즙액 추출 용액을 Table 1과 같이 조 성하였다. Tris 완충액은 1차 아민기를 가지고 있지만, DNA 및 RNA들을 이용한 생화학적 반응에 대해 안정적이고 Mg²⁺ 등의 양이온들에 의해서 침전이 일어나지 않는 특성 때문에 본 연구의 실험구로 사용되었다. 기존의 IC/RT-PCR 혹은 핵 산 추출 후 RT-PCR에 사용되는 인산 완충액 (1a ~ 1h)을 대 조구로 사용하였다 (Table 1). 비이온 계면활성제인 PEG 화합 물은 고추 등 식물들에서 핵산 추출의 방해 요소인 많은 산화 효소들 및 식물막의 지질 성분들과 결합하여 추출 효율을 높 일 수 있다. 또한 PEG 화합물은 식물 phenol류 성분들과 결 합하여 독성을 중화시키는 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다. TSWV가 감염된 고추 및 담배에서 마쇄한 즙액의 갈변 정도를 기준으로 하여 색깔 변화를 측정하였을 때, 모든 추출 용액에서 상온에 마쇄 후 방치하여도 갈변되지 않았다. 따라 서 담배에서 TSWV를 진단할 경우, 명기된 모든 조합의 완충 액들의 종류와 관계없이 안정적으로 RT-PCR에 사용이 가능 하다(Fig. 1). 그러나, 고추 즙액들의 마쇄 및 상온 방치 후 색깔 변화를 측정한 결과 1a, 1d, 1g, 1h 샘플들에서는 심한 갈변 현상이 관찰되었으며, 2f 및 2g에서는 적은 갈변 현상이 관찰되었다. 그러나, 2a 완충액 [1M Tris (pH8.0) 및 0.5% sodium sulfate]로 마쇄 후 상온 방치한 고추 즙액에서 갈변 현상이 관찰되지 않아, 고추 추출 용액으로 가장 좋은 효과가 좋았다 200 (Fig. 1). 또한 2b, 2c, 2d, 3b, 3d, 4c, 4d, 및 4e에서도 즙액 추출 후 갈변 현상이 일어났으나, 1a 등에서 관찰된 고추 갈변 현상에 비해 심하지 않았다. PMMoV 및 PepMoV 가 감염된 고추 잎들을 이용한 최적 즙액 완충액을 이용한 실험에서도 위에서 기술된 유사한 결과들이 도출되 었다.

즙액 추출 용액 내에서의 바이러스들의 안정성 조사

즙액 추출 용액에서의 TSWV, PMMoV, PepMoV들의 입자 및 핵산 분쇄 억제의 안정성을 측정하기 위하여, 위에서 기 술된 각 바이러스들이 감염된 고추 및 담배 식물체들의 잎을 동일한 방법으로 각각 다른 즙액 추출 완충액들로 추출 후 2, 4, 7일까지 실온에서 방치 한 후 VC/RT-PCR을 수행하여 바 이러스의 안정성을 분석하였다. 담배에서는 2, 4, 7일까지 실 온에서 방치된 즙액 완충액들에서 모두 안정적으로 TSWV, PMMoV 및 PepMoV가 검출이 되었으며, 이는 마쇄 직후 수 행된 VC/RT-PCR의 결과와 RT-PCR 산물의 증폭 정도가 유 사하였다 (Fig. 2). 이런 연구 결과는 담배에서는 본 연구에서 사용된 즙액 완충액들이 바이러스들의 입자 및 핵산의 분쇄를 억제시키는 안정화 역할을 수행하는 것을 의미하며, 이는 앞 서 기술한 갈변 현상 연구 결과들과 유사하였다(Fig. 1). 각각 다른 즙액 추출 완충액들로 추출 후 2, 4, 7일까지 실온에서 방치 한 고추 샘플들에서는 마쇄 후 4, 7일까지 방치된 샘플 들 모두에서는 TSWV, PMMoV, PepMoV 들이 검출이 되지 않았으나, 2일 후 방치된 샘플들에서는 대부분 TSWV, PMMoV, PepMoV들의 검출이 일부 되었으나 많은 샘플들에 서 검출 감도가 급격히 낮아진 것 나타났다 (Fig 3). 그러나 2a 샘플에서는 2일까지 3가지 바이러스들의 입자들 및 핵산 분쇄 억제 효과를 보여, VC/RT-PCR용 고추 즙액 완충액으로 서 가장 큰 효과가 있는 것으로 판명되었으며, 이의 결과는 갈변 현상의 연구 결과와 유사하다(Fig. 1과 Fig. 3). 위의 2a 고추 즙액 추출용액 및 Table 1에 표기된 즙액 추출용액을 이 용한 VC/RT-PCR 결과는 3회의 반복적인 실험들에서 동일하 게 관찰되었으며, 특히 반복된 실험들 모두에서 2a 즙액 추출 용액에서 가장 좋은 효과가 관찰되었다. 고추 잎 조직들을 이 용하여 바이러스들을 진단을 할 경우에는 갈변 현상이 나타나 지 않는 완충액을 이용하여야 하며, 갈변화 억제시킬 수 있는 방안은 고추에서 바이러스 RNA 추출 및 진단에서 중요한 요 인임을 의미한다.

고추 바이러스들의 VC/RT-PCR 다중 진단

최적의 즙액 완충액으로 선발된 2a 완충액을 이용하여 [1M Tris (pH8.0) 및 0.5% sodium sulfate], 농가들에서 수집된 고 추에서 TSWV, PMMoV, PepMoV의 단독 및 복합 감염된 고추 여부를 판별하기 위하여 고추 잎 조직들을 마쇄 후 3종 의 바이러스들을 검출 할 수 있는 6개 프라이머들을 한 개의 튜브에 넣은 후 VC/RT-PCR 다중 진단을 수행하였다. 프라이 머들의 간섭을 최소화 하기 위하여, 267bp RT-PCR 산물을 합성할 수 있는 TSWV 다중 진단용 프라이머 세트 [TSWV267-Forward (5'-ATGTTAACTCTTTTCGGTAA-3') 및 TSWV267-Rev (5'-CTATATTTCATCAAAGGATA-3')]를 제작 하여 다중 진단에 사용하였다. 2a 완충액과 고추 바이러스 특 이적 프라이머 세트를 이용한 진단 결과 TSWV, PepMoV, PepMoV의 단독 감염이 대부분이었으며, PMMoV와 PepMoV 들의 복합 감염도 확인이 되었다(Fig. 4). 그러나, TSWV+ PMMoV, TSWV + PepMoV의 복합 감염은 우리가 조사한 고 추 시료들에서는 검출이 안되었다. 본 연구 결과를 종합해보 면 즙액 완충액과 다중 VC/RT-PCR을 이용하여 고추에서 발 생하는 TSWV, PMMoV 및 PepMoV를 단독 및 복합 감염 을 간편하게 진단할 수 있는 방법으로 사료된다. 다중 바이러 스 진단에서 가장 중요한 요인은 프라이머들 사이의 간섭 효 과들이라고 알려져 있으며, 어떠한 식물 혹은 작물을 대상으 로 바이러스병 진단을 실시하는 가에 의해서 진단의 감도가 달라진다 (Zheng & Yang, 2002). 특히 polyphenol들 및 다 당류들이 많이 함유하고 있는 고추 및 고구마 등에서 바이러 스들을 진단할 경우에 핵산 분리가 매우 어려워 오류를 범할 가능성이 높은 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서 개발된 즙 액 완충액을 이용할 경우 바이러스들의 입자들 및 핵산을 안 정적으로 검출 할 수 있을 것으로 기대된다. 최근에 가장 일 반적으로 빠르게 보편적으로 식물바이러스들을 진단하는 분자 생물학적 방법 중 하나는 RT-PCR이며, 이는 보편적으로 RNA 혹은 DNA를 추출하여 정제하는 과정이 필수적이므로 시간 소요 및 경제적 비용이 발생한다 (Li & Mock, 2005; Osman & Rowhani, 2005). 이를 극복하기 위하여 바이러스 입자들을 감지하는 기술이 개발되었다 (James, 1999; Singh et al., 2005; Suehiro et al., 2005). 그러나 1개 작물에서 여 러 바이러스들을 동시 진단을 할 경우에는 프라이머 간섭 현 상 및 핵산의 점도 문제 등에 의해서 진단 효율에 큰 차이가 나타나는 것이 알려져 있다. 따라서, 진단 비용의 절감 및 프 라이머들의 간섭현상 억제에 의한 진단의 정확도를 높이는 대 안으로 VC/RT-PCR 방법이 개발되어 진단에 활용되고 있다 (Cho et al., 2006; Cho et al., 2008; Kim et al., 2010; Nolasco et al., 1993; Sharman et al., 2000). 본 연구에서 개발된 즙액 완충액을 이용할 경우 고추에 경제적 피해를 일 으키는 바이러스들의 입자들 및 핵산을 안정적으로 다중 진단 이 가능할 것으로 기대된다.

적 요

바이러스 입자를 감지하는 역전사 핵산 연쇄 증폭법 (VC/ RT-PCR)은 감염된 식물종들로부터 핵산 추출 없이 식물바이 러스들을 검출 할 수 있다. 본 연구는 VC/RT-PCR 분석법을 이용하여 고추를 감염시키는 바이러스들을 효과적으로 진단하 기 위하여 새로운 즙액 추출 완충액들이 제작하였다.

토마토반점위조바이러스 (Tomato spotted wilt virus; TSWV), 고추약한모틀바이러스 (Pepper mild mottle virus; PMMoV) 및 고추모틀바이러스 (Pepper mottle virus; PepMoV) 진단을 위한 가장 최적화된 추출 완충액은 0.5% sodium sulfate를 포함하는 1.0M Tris (pH 8.0) buffer 였다.

고추 바이러스들은 담배 즙액 추출 후 7일까지 검출이 되었 으며, 마쇄 직후와 검출 감도는 유의한 차이가 없었다. 반면에, 3가지 고추 바이러스들은 고추 즙액 추출 후 2일까지만 바이 러스들이 검출되었으며, 검출 감도는 크게 감소하였다.

국내 고추 재배 농가들에서 수집한 고추 시료들에서 TSWV, PMMoV, PepMoV의 단독 감염 및 PMMoV와 PepMoV의 중복 감염을 선발된 최적 즙액 완충액과 VC/RT-PCR의 조합 을 이용하여 동시 진단이 가능하였다.